Альбуминная масса: Творожок Fitness time Альбуминный Шоколад

2

2

РИС.2.

Идентификация альбумина методом масс-спектрометрии. Показан масс-спектр вызванной столкновением диссоциации пептида Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys альбумина мыши. Родительский ион имеет отношение массы к заряду (m / z) 1149,64. FP-биотинилированный альбумин получали от трех мышей, получавших FP-биотин.

РИС. 2.

Идентификация альбумина методом масс-спектрометрии. Показан масс-спектр вызванной столкновением диссоциации пептида Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys альбумина мыши.Родительский ион имеет отношение массы к заряду (m / z) 1149,64. FP-биотинилированный альбумин получали от трех мышей, получавших FP-биотин.

FP-биотинилированный AChE и BChE не были обнаружены, поскольку этих белков недостаточно для получения полосы, окрашенной кумасси синим, на гелях SDS. В этой работе с помощью масс-спектрометрии анализировали только белки, дающие полосу, окрашенную кумасси.

Идентификация эндогенных биотинилированных белков

Эндогенные биотинилированные белки идентифицировали масс-спектрометрией.Белки в таблице 2 были обнаружены в мышцах необработанных мышей, а также мышей, получавших FP-биотин. Это пропионил-КоА-карбоксилаза альфа, пируваткарбоксилаза и метилкротонил-КоА-карбоксилаза альфа. Эти эндогенные биотинилированные белки связывались с гранулами авидина и были в достаточном количестве, чтобы их можно было визуализировать в виде полос кумасси синего на геле SDS.

ТАБЛИЦА 2

Масс-спектральная идентификация биотинилированных белков, экстрагированных из мышц необработанных мышей, а также мышей, получавших FP-биотин

4.1.1

ТАБЛИЦА 2

Масс-спектральная идентификация биотинилированных белков, экстрагированных из необработанных мышц, а также обработанных FP-биотином мышей

073

альфа-карбоксил

Блот, показывающий FP-биотинилированные белки в плазме мыши

Блот, показывающий белки в плазме, которые стали меченными FP-биотином после обработки мышей FP-биотином, показан на Фигуре 3.Дозы 1 и 5 мг / кг FP-биотина не были токсичными для животных. Интенсивная широкая полоса в середине геля разделялась на три полосы при серийном разбавлении плазмы мыши. Верхняя полоса в триплете — карбоксилэстераза (СЕ), средняя полоса — альбумин, а нижняя полоса не идентифицирована.

РИС. 3.

FP-биотинилированные белки в плазме мыши, визуализированные с помощью стрептавидина Alexa-680. Мышам вводили 0, 1 или 5 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно.Через два часа была взята кровь. Белки плазмы разделяли на неденатурирующем полиакриламидном геле с градиентом 4–30%. Белки переносили на мембрану PVDF, и биотинилированные белки визуализировали путем гибридизации блота со стрептавидином Alexa-680. Объем мышиной плазмы, загруженной на дорожку, составлял от 5 до 0,005 мкл. На две дорожки, отмеченные BSA, вводили 0,25 мкг биотинилированного BSA на дорожку. На две дорожки, обозначенные БХЭ, приходилось 0,020 мкг биотинилированной БХЭ на дорожку.

РИС. 3.

FP-биотинилированные белки в плазме мыши, визуализированные с помощью стрептавидина Alexa-680.Мышам вводили 0, 1 или 5 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Через два часа была взята кровь. Белки плазмы разделяли на неденатурирующем полиакриламидном геле с градиентом 4–30%. Белки переносили на мембрану PVDF, и биотинилированные белки визуализировали путем гибридизации блота со стрептавидином Alexa-680. Объем мышиной плазмы, загруженной на дорожку, составлял от 5 до 0,005 мкл. На две дорожки, отмеченные BSA, вводили 0,25 мкг биотинилированного BSA на дорожку. На две дорожки, обозначенные БХЭ, приходилось 0,020 мкг биотинилированной БХЭ на дорожку.

Полоса биотинилированной БуХЭ была видна в плазме мышей, получавших 5 мг / кг, но не 1 мг / кг FP-биотина. Это согласуется с нашим открытием, что активность БуХЭ подавлялась примерно на 35% после обработки 5 мг / кг, но не подавлялась после обработки 1 мг / кг FP-биотина.

Помимо альбумина, карбоксилэстеразы и бутирилхолинэстеразы, плазма мышей содержит около восьми других биотинилированных полос, белковая идентичность которых неизвестна. Интенсивность полосы в верхней части геля выше, чем у мышиной БХЭ, что позволяет предположить, что этот белок более распространен, чем БХЭ, и что он обладает высокой реакционной способностью.По интенсивности остальные полосы равны БХЭ или ниже. Таким образом, плазма мыши содержит по меньшей мере 11 белков, которые связывают OP в физиологических условиях в дозах OP, которые не вызывают токсических признаков.

По оценкам, около 1-2% альбумина в плазме мыши связано с FP-биотином у мышей, получавших 5 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Однако в плазме мышей содержится намного больше альбумина (50 мг / мл), чем БХЭ (0,003 мг / мл), что альбумин потребляет значительное количество FP-биотина. Сходные интенсивности биотинилированных полос были получены на фиг. 3 для БуХЭ в неразбавленной плазме и для альбумина, разбавленного в 1000 раз, что позволяет предположить, что альбумин связывает в 1000 раз больше FP-биотина, чем связывает БуХЭ.

Гели, окрашенные активностью

Гели на рисунках 3-5 представляли собой неденатурирующие полиакриламидные гели. Использовали неденатурирующие гели, поскольку в этих условиях тетрамер БХЭ 340 кДа хорошо отделялся от альбумина 67 кДа. Это разделение невозможно на гелях SDS, потому что альбумин (67000 МВт) в 10 000 раз более распространен в плазме, чем БХЭ (85000 МВт), и распространяется в широкую полосу, которая перекрывается с полосой БХЭ, что делает невозможным визуализацию БХЭ.Вторая причина использования неденатурирующих гелей заключается в том, что неденатурирующие гели позволяют идентифицировать БуХЭ и карбоксилэстеразу на основе активности. На рисунке 4 показана активность с бета-нафтилацетатом. Интенсивная полоса представляет собой карбоксилэстеразу (EC 3.1.1.1, CE) в плазме мыши. Пузырек под карбоксилэстеразой — это альбумин. БХЭ, а также несколько неидентифицированных белков также реагируют с бета-нафтилацетатом. На рис. 5 показана активность белков крови с бутирилтиохолином. Тетрамер БХЭ представляет собой интенсивную полосу в верхней части геля.Выровняв полосы на рисунках 3, 4 и 5, мы подтвердили идентичность биотинилированного альбумина, карбоксилэстеразы и БуХЭ на рисунке 3.

РИС. 4.

Неденатурирующий гель, окрашенный на карбоксилэстеразную активность. Мышам вводили 0, 5 или 18,8 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Кровь была взята через 2 часа; На дорожку загружали 1–5 мкл плазмы. Неденатурирующий гель окрашивали на карбоксилэстеразную активность. Интенсивная полоса — карбоксилэстераза (СЕ). Альбумин мигрирует сразу под карбоксилэстеразой.На дорожку, обозначенную Hu, вводили 5 мкл необработанной плазмы человека. Обратите внимание, что человеческая плазма не содержит карбоксилэстеразы.

РИС. 4.

Неденатурирующий гель, окрашенный на карбоксилэстеразную активность. Мышам вводили 0, 5 или 18,8 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Кровь была взята через 2 часа; На дорожку загружали 1–5 мкл плазмы. Неденатурирующий гель окрашивали на карбоксилэстеразную активность. Интенсивная полоса — карбоксилэстераза (СЕ). Альбумин мигрирует сразу под карбоксилэстеразой.На дорожку, обозначенную Hu, вводили 5 мкл необработанной плазмы человека. Обратите внимание, что человеческая плазма не содержит карбоксилэстеразы.

РИС. 5.

Неденатурирующий гель, окрашенный на активность БХЭ. Мышам вводили 0, 5 или 18,8 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Кровь собирали через 2 часа. На каждую дорожку загружали 5 мкл мышиной плазмы. На дорожку, обозначенную Hu, вводили 5 мкл необработанной плазмы человека. Несмотря на 35-80% ингибирование мышиной BChE, оставалось достаточно активности BChE, чтобы дать характерный образец полос BChE.Полоса тетрамера содержит около 95% общей активности. Полосы мономера и димера являются второстепенными компонентами. Обратите внимание, что полосы тетрамера БХЭ человека и мыши мигрируют в сходные положения.

РИС. 5.

Неденатурирующий гель, окрашенный на активность БХЭ. Мышам вводили 0, 5 или 18,8 мг / кг FP-биотина внутрибрюшинно. Кровь собирали через 2 часа. На каждую дорожку загружали 5 мкл мышиной плазмы. На дорожку, обозначенную Hu, вводили 5 мкл необработанной плазмы человека. Несмотря на 35-80% ингибирование мышиной BChE, оставалось достаточно активности BChE, чтобы дать характерный образец полос BChE.Полоса тетрамера содержит около 95% общей активности. Полосы мономера и димера являются второстепенными компонентами. Обратите внимание, что полосы тетрамера БХЭ человека и мыши мигрируют в сходные положения.

Другие ОП конкурируют с FP-биотином за связывание с альбумином

Целью этого эксперимента было определить, связываются ли другие OP с альбумином. Мы хотели знать, является ли связывание с альбумином особым свойством FP-биотина или другие OP также связываются с альбумином. Если сайт связывания OP представляет собой специфический тирозин (Black et al ., 1999; Sanger, 1963), то ожидалось, что предварительная обработка другим OP блокирует связывание FP-биотина. В этом эксперименте использовалась человеческая плазма, поскольку она не содержит карбоксилэстеразу. Отсутствие карбоксилэстеразы облегчило интерпретацию результатов, поскольку не было путаницы между карбоксилэстеразой и альбумином. На рис. 6 показано, что другие OP в различной степени конкурировали с FP-биотином за связывание с альбумином. Предварительная обработка хлорпирифосоксоном, эхотиофатом, малаоксоном, параоксоном, метилпараоксоном, диазоксоном, дихлофосом и диизопропилфторфосфатом (DFP) уменьшала связывание FP-биотина с человеческим альбумином in vitro .Единственным протестированным OP, который не показал связывания с альбумином, был тетраизопропилпирофосфорамид (изо-OMPA).

РИС. 6.

Связывание FP-биотина с человеческим альбумином ингибируется хлорпирифосоксоном и другими OP. В этом эксперименте проверяется способность OP блокировать связывание FP-биотина с альбумином. Человеческую плазму, разведенную 1: 100, инкубировали in vitro с малаоксоном, параоксоном, хлорпирифосоксоном (CPO), метилпараоксоном, дихлофосом, диизопропилфторфосфатом (DFP), диазоксоном, эхотиофатом (эхо) или изо-OMPA в течение 1 ч. перед добавлением FP-биотина (FPB).Дорожку, обозначенную FPB, обрабатывали только FP-биотином. 10 мкл, содержащего эквивалент 0,1 мкл плазмы, загружали на дорожку в двух экземплярах на неденатурирующий гель. Биотинилированные белки визуализировали с помощью стрептавидина Alexa-680 после переноса на PVDF-мембрану. Интенсивность полосы биотинилированного альбумина снижалась всеми OP, кроме изо-OMPA, что указывает на то, что все OP, кроме изо-OMPA, конкурировали с FP-биотином за связывание с человеческим альбумином.

РИС. 6.

Связывание FP-биотина с человеческим альбумином ингибируется хлорпирифосоксоном и другими OP.В этом эксперименте проверяется способность OP блокировать связывание FP-биотина с альбумином. Человеческую плазму, разведенную 1: 100, инкубировали in vitro с малаоксоном, параоксоном, хлорпирифосоксоном (CPO), метилпараоксоном, дихлофосом, диизопропилфторфосфатом (DFP), диазоксоном, эхотиофатом (эхо) или изо-OMPA в течение 1 ч. перед добавлением FP-биотина (FPB). Дорожку, обозначенную FPB, обрабатывали только FP-биотином. 10 мкл, содержащего эквивалент 0,1 мкл плазмы, загружали на дорожку в двух экземплярах на неденатурирующий гель.Биотинилированные белки визуализировали с помощью стрептавидина Alexa-680 после переноса на PVDF-мембрану. Интенсивность полосы биотинилированного альбумина снижалась всеми OP, кроме изо-OMPA, что указывает на то, что все OP, кроме изо-OMPA, конкурировали с FP-биотином за связывание с человеческим альбумином.

Эти результаты предполагают, что связывание OP с альбумином является общим свойством OP. Следует отметить, что в этом отчете было продемонстрировано, что FP-биотин связывается с альбумином трех видов: мыши, крупного рогатого скота и человека.Альбумины присутствовали в плазме мышей, очищенном бычьем сывороточном альбумине и плазме человека.

ОБСУЖДЕНИЕ

OP маркирует белки, у которых нет активного сайта серина

Фосфорорганические токсиканты хорошо известны как ингибиторы сериновых протеаз и сериновых эстераз. Ферменты, такие как трипсин, химотрипсин, тромбин, AChE, BChE, ацилпептидгидролаза и карбоксилэстераза, имеют серин консервативного активного сайта с консенсусной последовательностью GXSXG.Когда серин активного центра ковалентно модифицируется OP, фермент теряет активность. Потеря активности фермента позволяет удобно измерять реактивность с OP.

Белки без каталитической активности представляют собой новый класс белков-мишеней OP. У них нет серина в активном центре, и было показано, что они связывают OP in vitro , но не у живых животных. Появление квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии позволило точно идентифицировать альбумин как белок, связывающий OP FP-биотин у живых мышей.

Эксперименты с очищенными белками документально подтвердили ковалентное присоединение OP не только к серину, но также к тирозину и гистидину. Например, альбумин человека ковалентно связывает зарин, зоман и DFP по тирозину (Black et al ., 1999; Means and Wu, 1979). Альбумин бычьей сыворотки легко фосфорилируется DFP со стехиометрией, равной одной связанной молекуле DFP на молекулу альбумина (Murachi, 1963). Последовательность пептида альбумина, ковалентно связывающего DFP, была описана Сэнгером как ArgTyrThrLys для человеческого и кроличьего альбумина и ArgTyrThrArg для бычьего альбумина (Sanger, 1963).После того, как были известны полные аминокислотные последовательности альбуминов, эти реактивные тирозины были идентифицированы как Tyr 411 в человеческом и Tyr 410 в бычьем альбумине (Meloun et al ., 1975; Peters, 1996). Папаин связывает DFP с тирозином (Chaiken and Smith, 1969), тогда как карбоксилэстераза печени кролика связывает DFP с гистидином, а также с серином в активном центре (Korza and Ozols, 1988). Бромелайн не ингибируется DFP, но он реагирует с DFP, что приводит к образованию полностью активного фосфорсодержащего фермента (Murachi, 1963; Murachi et al ., 1965). Мускариновый ацетилхолиновый рецептор M2 крысы ковалентно связывает хлорпирифосоксон, хотя сайт связывания еще не идентифицирован (Bomser and Casida, 2001; Huff et al. ., 1994).

Ранее было продемонстрировано, что живые животные связывают OP с нехолинэстеразными сайтами. Распределение в тканях радиоактивно меченного DFP у кроликов (Jandorf and McNamara, 1950) и радиоактивно меченного зомана в головном мозге крыс и мышей (Little et al ., 1988; Traub, 1985) не коррелировало с локализацией холинэстеразы.Эти результаты были интерпретированы как означающие, что тканевые белки, отличные от холинэстеразы, способны связывать яды OP (Jandorf and McNamara, 1950; Kadar et al ., 1985).

Существующие масс-спектрометрические методы диагностики воздействия ОП

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией использовалась для обнаружения зарина в архивных образцах крови жертв атаки в токийском метро в 1995 году (Polhuijs et al ., 1997). Ковалентно связанный зарин в 0.Высвобождали от 12 до 0,5 мл сыворотки путем инкубации с 2 М фторидом калия при pH 4,0. Этот метод подтвердил, что люди подвергались воздействию OP и, кроме того, идентифицировал OP как зарин. Отношение массы к заряду высвобожденных фрагментов ОП составляло 81, 99 и 125, что характерно для зарина.

Метод ГХ-МС — это значительный шаг вперед по сравнению с простыми анализами ингибирования, но у него есть ограничения. (1) Метод основан на возможности высвобождения OP из его ковалентного сайта присоединения на БуХЭ с фторидом калия.Этап высвобождения требует, чтобы каталитический аппарат БХЭ был неповрежденным. Образцы, которые хранились способами, денатурирующими БуХЭ, не могут подвергнуться индуцированному фторидом высвобождению OP (Polhuijs et al ., 1997). (2) Белки, отличные от БХЭ, АХЭ и карбоксилэстеразы, могут не выделять ФП при обработке фторидом калия. Альбумин человека после фосфилирования зарином не поддается реактивации ионами фтора (Van Der Schans et al ., 2004). (3) Образцы OP-дериватизированных белков, которые потеряли алкильную группу из фосфоната в процессе, называемом «старение», не будут способны высвобождать свой OP после обработки фторидом калия.

ГХ-МС метаболитов OP — метод, рекомендованный Центрами по контролю за заболеваниями для мониторинга потенциального воздействия нервно-паралитических агентов. Измерение метаболитов OP ограничено тем фактом, что эти соединения быстро выводятся из организма. Метаболиты зарина были обнаружены в моче на 1-й и 3-й дни после воздействия, а также в следовых количествах на 7-й день у человека, который вдохнул дозу, которая привела к потере сознания (Nakajima et al ., 1998). Образцы мочи четырех пациентов, госпитализированных в связи с воздействием зарина, показали, что большая часть метаболитов зарина выводится в течение 24 часов (Hui and Minami, 2000).

Многие из этих ограничений были преодолены в подходе, при котором БуХЭ плазмы очищали с помощью аффинной хроматографии и расщепляли пепсином. Пептиды разделяли жидкостной хроматографией, и OP-дериватизированный пептид, а также OP, который он нес, идентифицировали тандемной масс-спектрометрией с электрораспылением (Fidder et al ., 2002). Этот метод хорошо подходит для обнаружения воздействия OP и станет еще более ценным, если в анализ будут включены белки, производные OP, отличные от BChE.Основным преимуществом использования связанного с белком OP для диагностики воздействия является то, что производные OP-белки остаются в кровотоке в течение нескольких недель (Cohen and Warringa, 1954; Grob et al ., 1947; Munkner et al ., 1961; Van Der Schans et al ., 2004).

Свойства альбумина

Альбумин представляет собой негликозилированную одиночную цепь из 585 аминокислот, свернутую в три домена 17 внутрицепочечными дисульфидными связями. Альбумин — это самый распространенный растворимый белок в организме всех позвоночных и самый заметный белок в плазме.Он синтезируется в печени и попадает в кровоток. Из 360 г общего альбумина у человека 40% находится в крови и 60% — во внесосудистых жидкостях тканей (Peters, 1996). Скорость переноса во внесосудистое пространство составляет около 4,5% в час. Около 40% внесосудистого альбумина находится в мышцах. Альбумин отвечает за коллоидно-осмотическое давление плазмы и за поддержание объема крови и обеспечивает большую часть кислотно-основного буферного действия белков плазмы во внесосудистых жидкостях.Альбумин связывает и транспортирует метаболиты и лекарства. Анальбуминия, редкий дефицит альбумина, совместима с почти нормальным здоровьем человека. Изучение анальбуминемии показывает, что альбумин помогает справиться со стрессом и удерживает экологические и физиологические токсины.

Альбумин и БХЭ — привлекательные биомаркеры для отравления ОП

Как альбумин, так и БуХЭ обнаруживаются в плазме человека, ткани, из которой можно легко определить биомаркеры воздействия ОП.Оба белка связывают OP, хотя связывание с альбумином OP, отличного от FP-биотина, не было продемонстрировано in vivo . Оба белка имеют длительный период полураспада в кровотоке человека: 20 дней для альбумина (Chaudhury et al ., 2003; Peters, 1996) и 10-16 дней для BChE (Cohen and Warringa, 1954; Jenkins et al. ., 1967; Munkner et al. ., 1961; Ostergaard et al ., 1988). Длительный период полужизни OP-меченых белков контрастирует с коротким периодом полужизни OP и метаболитов OP в моче.Это дает значительное преимущество методу, использующему белки, меченные OP, для диагностики воздействия OP.

Роль альбумина в токсичности OP

Связывание OP с альбумином может служить для поглощения молекул OP и, следовательно, уменьшения количества OP, доступного для реакции с AChE. Сродство различных OP к альбумину, вероятно, будет различаться, поэтому эффективность альбумина как поглотителя OP, вероятно, будет зависеть от идентичности OP.

Еще одним соображением при оценке роли альбумина в токсичности OP является конкуренция с лекарствами за связывание с одним и тем же сайтом в альбумине.Некоторые препараты, включая диазепам (Fehske et al ., 1979; Peters, 1996) и ибупрофен, связываются с той же областью альбумина, которая связывает OP (см. Таблицы 3-5 в Peters, 1996). Поскольку свободная форма лекарства активна, степень связывания с альбумином контролирует как эффект, так и продолжительность действия лекарства. Снижение связывания лекарства с альбумином может вызвать токсичность из-за увеличения концентрации его свободной формы. Таким образом, человек, проходящий лечение от кишечных червей метрифонатом (OP, который неферментативно превращается в дихлофос), может быть неспособен переносить стандартную дозу диазепама или ибупрофена.Или, наоборот, человек, принимающий ибупрофен, может иметь непереносимость стандартной дозы метрифоната.

При поддержке командования медицинских исследований и материально-технического снабжения армии США гранты DAMD17-01–1–0776 (для OL) и DAMD17-01–0795 (для CMT), грант на поддержку онкологического центра UNMC Eppley P30CA36727, грант Национального научного фонда MCB9808372 (для CMT), EPS00

(для CMT) и грант Команды исследований, разработок и инженерии армии США W911SR-04-C-0019 (для OL) Информация не обязательно отражает позицию или политику Соединенного Королевства.S. Правительство, и никакого официального одобрения не следует делать. Холли Кугенур из Университета Монтаны представила протокол восстановления, алкилирования и переваривания белков в геле. Мы благодарим анонимного рецензента за полезные ссылки на взаимодействие OP с альбумином.

ССЫЛКИ

Блэк Р. М., Харрисон Дж. М. и Рид Р. У. (

1999

). Взаимодействие зарина и зомана с белками плазмы: идентификация нового сайта фосфонилирования.

Arch. Toxicol.

73

,

123

–126.

Бомсер, Дж. А. и Касида, Дж. Э. (

2001

). Диэтилфосфорилирование мускаринового рецептора M2 сердца крысы хлорпирифосоксоном in vitro .

Toxicol. Lett.

119

,

21

–26.

Касида, Дж. Э. и Кистад, Г. Б. (

2004

). Токсикология фосфорорганических соединений: аспекты безопасности вторичных мишеней неацетилхолинэстеразы.

Chem.Res. Toxicol.

17

,

983

–998.

Чайкен И. М. и Смит Э. Л. (

1969

). Реакция специфического тирозинового остатка папаина с диизопропилфторфосфатом.

J. Biol. Chem.

244

,

4247

–4250.

Чаудхури, С., Мехназ, С., Робинсон, Дж. М., Хейтон, В. Л., Перл, Д. К., Рупениан, Д. К., и Андерсон, К. Л. (

2003

). Связанный с основным комплексом гистосовместимости рецептор Fc для IgG (FcRn) связывает альбумин и продлевает его продолжительность жизни.

J. Exp. Med.

197

,

315

–322.

Коэн, Дж. А., и Уорринга, М. Г. (

1954

). Судьба диизопропилфторфосфоната, меченного P32, в организме человека и его использование в качестве маркирующего агента при исследовании круговорота плазмы крови и эритроцитов.

J. Clin. Вкладывать деньги.

33

,

459

–467.

Дуйсен, Э. Г., Страйбли, Дж. А., Фрай, Д. Л., Хинрикс, С. Х. и Локридж, О. (

2002

).Спасение мышей с нокаутом ацетилхолинэстеразы путем кормления жидкой диетой; фенотип взрослой мыши с дефицитом ацетилхолинэстеразы.

Brain Res. Dev. Brain Res.

137

,

43

–54.

Эллман, Г. Л., Кортни, К. Д., Андрес, В., младший, и Фезер-Стоун, Р. М. (

1961

). Новое быстрое колориметрическое определение активности ацетилхолинэстеразы.

Biochem. Pharmacol.

7

,

88

–95.

Фехске К. Дж., Мюллер У. Э. и Воллерт У. (

1979

). Высокоактивный остаток тирозина как часть сайта связывания индола и бензодиазепина сывороточного альбумина человека.

Биохим. Биофиз. Acta

577

,

346

–359.

Фиддер, А., Хюльст, А.Г., Ноорт, Д., де Руйтер, Р., ван дер Сханс, М. Дж., Беншоп, Х. П., и Лангенберг, Дж. П. (

2002

). Ретроспективное обнаружение воздействия фосфорорганических антихолинэстераз: масс-спектрометрический анализ фосфилированной бутирилхолинэстеразы человека.

Chem. Res. Toxicol.

15

,

582

–590.

Гроб Д., Лилиенталь Дж. Л., Харви А. М. и Джонс Б. Ф. (

1947

). Назначение диизопропилфторфосфата (DFP) человеку. I. Влияние на холинэстеразу плазмы и эритроцитов; общесистемные эффекты; использование при изучении функции печени и эритропоэза; и некоторые свойства холинэстеразы плазмы.

Бык. Johns Hopkins Hosp.

81

,

217

–244.

Хафф Р. А., Коркоран Дж. Дж., Андерсон Дж. К. и Абу-Дония М. Б. (

1994

). Хлорпирифосоксон напрямую связывается с мускариновыми рецепторами и ингибирует накопление цАМФ в полосатом теле крысы.

J. Pharmacol. Exp. Ther.

269

,

329

–335.

Хуэй Д. М. и Минами М. (

2000

). Мониторинг фтора в образцах мочи пациентов, пострадавших от зариновой катастрофы в Токио, в связи с обнаружением других продуктов разложения зарина и побочных продуктов, образующихся в процессе синтеза зарина.

Clin. Чим. Acta

302

,

171

–188.

Джандорф, Б. Дж., И Макнамара, П. Д. (

1950

). Распределение радиоактивного фосфора в тканях кролика после введения меченного фосфором диизопропилфторфосфата.

J. Pharmacol. Exp. Ther.

98

,

77

–84.

Дженкинс Т., Балински Д. и Пациент Д. У. (

1967

). Холинэстераза в плазме: первое сообщение об отсутствии у банту; определение периода полураспада.

Наука

156

,

1748

–1750.

Кадар, Т., Раве, Л., Коэн, Г., Оз, Н., Баранес, И., Балан, А., Ашани, Ю., и Шапира, С. (

1985

). Распределение 3H-зомана у мышей.

Arch. Toxicol.

58

,

45

–49.

Каднер С., Кац Дж. И Финли Т. Х. (

1992

). Эстераза-1: онтогенетическая экспрессия у мышей и распределение родственных белков у других видов.

Arch. Биохим. Биофиз.

296

,

435

–441.

Карновский М. Дж. И Рутс Л. (

1964

). Метод «прямого окрашивания» тиохолином холинэстераз.

J. Histochem. Cytochem.

12

,

219

–221.

Кидд Д., Лю Ю. и Краватт Б. Ф. (

2001

). Профилирование активности серингидролазы в сложных протеомах.

Биохимия

40

,

4005

–4015.

Корза Г., Озолс Дж. (

1988

). Полная ковалентная структура эстеразы 60 кДа, выделенной из микросом печени кролика, индуцированной 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксином.

J. Biol. Chem.

263

,

3486

–3495.

Литтл П. Дж., Шимека Дж. А. и Мартин Б. Р. (

1988

). Распределение [3H] диизопропилфторфосфата, [3H] зомана, [3H] зарина и их метаболитов в мозге мышей.

Drug Metab. Dispos.

16

,

515

–520.

Лю Ю., Патричелли М. П. и Краватт Б. Ф. (

1999

). Профилирование белков на основе активности: сериновые гидролазы.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

96

,

14694

–14699.

Макдонаф, Дж. Х., младший, и Ши, Т. М. (

1997

). Нейрофармакологические механизмы эпилептических припадков, вызванных нервно-паралитическими агентами, и невропатологии.

Neurosci. Biobehav. Ред.

21

,

559

–579.

Средство, G.Э. и Ву Х. Л. (

1979

). Реактивный остаток тирозина сывороточного альбумина человека: характеристика его реакции с диизопропилфторфосфатом.

Arch. Биохим. Биофиз.

194

,

526

–530.

Мелоун Б., Моравек Л. и Костка В. (

1975

). Полная аминокислотная последовательность сывороточного альбумина человека.

FEBS Lett.

58

,

134

–137.

Мозер, В. К. (

1995

).Сравнение острых эффектов ингибиторов холинэстеразы с использованием батареи нейроповеденческого скрининга на крысах.

Neurotoxicol. Тератол.

17

,

617

–625.

Мункнер Т., Мацке Дж. И Видебаек А. (

1961

). Холинэстеразная активность плазмы человека после внутримышечного введения диизопропилфторфосфоната (DFP).

Acta Pharmacol. Toxicol. (Копенгаген)

18

,

170

–174.

Мурачи, Т.(

1963

). Общая реакция диизопропилфосфорофторидата с белками без прямого влияния на ферментативную активность.

Биохим. Биофиз. Acta

71

,

239

–241.

Мурачи Т., Инагами Т. и Ясуи М. (

1965

). Доказательства алкилфосфорилирования тирозильных остатков стеблевого бромелаина диизопропилфосфорфторидатом.

Биохимия

4

,

2815

–2825.

Нахлас, М.М., Селигман А. М. (

1949

). Гистохимическая демонстрация эстеразы.

J. Natl. Cancer Inst.

9

,

415

–425.

Накадзима, Т., Сасаки, К., Одзава, Х., Секдзима, Ю., Морита, Х., Фукусима, Ю., и Янагисава, Н. (

1998

). Метаболиты зарина в моче у пациента, пострадавшего от зарина в Мацумото.

Arch. Toxicol.

72

,

601

–603.

Ортигоса-Ферадо, Дж., Рихтер, Р. Дж., Хорнунг, С. К., Мотульски, А. Г., и Ферлонг, К. Э. (

1984

). Гидролиз параоксона в сыворотке человека, опосредованный генетически изменчивой арилэстеразой и альбумином.

г. J. Hum. Genet.

36

,

295

–305.

Остергаард, Д., Виби-Могенсен, Дж., Ханель, Х. К., и Сковгаард, Л. Т. (

1988

). Период полувыведения холинэстеразы плазмы.

Acta Anaesthesiol. Сканд.

32

,

266

–269.

Петерс Т. младший (

1996

). Все об альбумине. Биохимия, генетика и медицина . Академик Пресс Лтд., Лондон.

Polhuijs, M., Langenberg, J.P., and Benschop, H.P. (

,

, 1997,

). Новый метод ретроспективного обнаружения воздействия фосфорорганических антихолинэстераз: Применение к предполагаемым жертвам зарина японских террористов.

Toxicol. Прил. Pharmacol.

146

,

156

–161.

Папа, К.Н. (

1999

). Фосфорорганические пестициды: все ли они обладают одним и тем же механизмом токсичности?

J. Toxicol. Environ. Здоровье B Crit. Ред.

2

,

161

–181.

Рэй Д. Э. и Ричардс П. Г. (

2001

). Возможность токсических эффектов хронического воздействия низких доз органофосфатов.

Toxicol. Lett.

120

,

343

–351.

Салви, Р. М., Лара, Д. Р., Гисолфи, Э. С., Портела, Л. В., Диас, Р. Д., и Соуза, Д. О. (

2003

). Нейропсихиатрическая оценка субъектов, хронически подвергающихся воздействию фосфорорганических пестицидов.

Toxicol. Sci.

72

,

267

–271.

Зангер, Ф. (

1963

). Аминокислотные последовательности в активных центрах определенных ферментов.

Proc. Chem. Soc.

5

,

76

–83.

Шварц, М. (

1982

). Активность сериновой протеазы человеческого сывороточного альбумина в отношении 4-метилумбеллиферилгуанидинобензоата (MUGB) и диизопропилфторфосфата (DEP): значение использования реактивности MUGB в околоплодных водах при пренатальной диагностике муковисцидоза.

Clin. Чим. Acta

124

,

213

–223.

Шривастава, А.К., Гупта, Б.Н., Бихари, В., Матур, Н., Шривастава, Л.П., Пангтей, Б.С., Бхарти, Р.С., и Кумар, П. (

2000

). Клинические, биохимические и нейроповеденческие исследования рабочих, занятых в производстве хиналфоса.

Food Chem. Toxicol.

38

,

65

–69.

Султатос, Л. Г., Баскер, К. М., Шао, М., и Мерфи, С. Д. (

1984

).Взаимодействие фосфоротиоатных инсектицидов хлорпирифоса и паратиона и их кислородных аналогов с бычьим сывороточным альбумином.

Мол. Pharmacol.

26

,

99

–104.

Тове, С. Б. (

1962

). Эстеролитическая активность сывороточного альбумина.

Биохим. Биофиз. Acta

57

,

230

–235.

Трауб, К. (

1985

). In vivo Распределение 14C радиоактивно меченного зомана [3,3-диметил-2-бутокси) метилфосфорилфторида) в центральной нервной системе крысы.

Neurosci. Lett.

60

,

219

–225.

Ван дер Шанс, М. Дж., Полхейс, М., Ван Дейк, К., Дегенхард, К. Э., Плейсер, К., Лангенберг, Дж. П., и Беншоп, Х. П. (

2004

). Ретроспективное обнаружение воздействия нервно-паралитических агентов: анализ фосфофторидатов, возникающих в результате индуцированной фторидом реактивации фосфилированного BuChE.

Arch. Toxicol.

78

,

508

–524.

Се, В., Страйбли, Дж.А., Шатоннет А., Уайлдер П. Дж., Риццино А., МакКомб Р. Д., Тейлор П., Хинрикс С. Х. и Локридж О. (

2000

). Задержка постнатального развития и сверхчувствительность к органофосфатам у мышей, нацеленных на ген, лишенных ацетилхолинэстеразы.

J. Pharmacol. Exp. Ther.

293

,

896

–902.

Заметки автора

* Медицинский центр Университета Небраски, Институт Эппли, Омаха, Небраска 68198–6805; и † Университет Монтаны, Департамент биомедицинских и фармацевтических наук, Миссула, Монтана 59812

Toxicological Sciences vol.83 нет. 2 © Общество токсикологии 2005; все права защищены.

Характеристика изоформ человеческого сывороточного альбумина с помощью ионообменной хроматографии в сочетании с нативной масс-спектрометрией

Основные моменты

•

IEX, соединенный с нативным МС, был использован для характеристики изоформ HSA.

•

Варианты заряда HSA были эффективно разделены методом IEX с летучими солями.

•

Расщепленные, окисленные и гликированные формы HSA контролировали в одном анализе.

•

Связывание Cu (II) с высоким сродством к HSA отслеживали на уровне изоформ.

Abstract

Сывороточный альбумин человека является наиболее распространенным белком плазмы и проявляет широкий спектр неонкотических свойств, таких как антиоксидантная активность, распределение в тканях и органах связывающих молекул и выведение токсичных соединений. Альбумин подвержен многочисленным посттрансляционным модификациям и, в частности, связан с его свободной тиоловой группой по Cys ₃₄ , которая является основным циркулирующим поглотителем активных форм кислорода.Характеристика этих модификаций представляет большой интерес для диагностики и лечения пациентов с заболеваниями печени, а также для оценки структурной целостности альбумина как терапевтического белка.

В этом исследовании был разработан метод ионообменной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией в реальном времени, чтобы объединить эффективный метод разделения вариантов заряда с мощным методом идентификации для детальной характеристики изоформ альбумина. Хроматографические характеристики метода позволяют разделить 9 различных изоформ, которые были в оперативном режиме охарактеризованы МС как окисленные, гликированные, деамидированные и усеченные по N / C-концу формы.Этот метод также позволяет обнаруживать связывание ионов Cu (II) с N-концевым участком белка, что является важным антиоксидантным свойством альбумина. Наконец, метод показал предварительные хорошие рабочие параметры с точки зрения линейности, точности и чувствительности для характеристики очищенного альбумина, а также альбумина из сырой плазмы для клинических и фармацевтических целей.

Сокращения

Ионообменная хроматография IEX

Ключевые слова

Масс-спектрометрия

Ионообменная хроматография

Окисление

Варианты заряда

Альбумин сыворотки человека

Рекомендуемые статьи .V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Образование и перестановка дисульфидных связей в бычьем сывороточном альбумине продемонстрировано с помощью тандемной масс-спектрометрии с диссоциацией, вызванной столкновениями и переносом электрона

Альбумин | Лабораторные тесты онлайн

Источники, использованные в текущем обзоре

2019 обзор выполнен Нэнси Альбтуш, доктором философии.

(13 января 2015 г.) Деварадж, С. Альбумин.Medscape. Доступно на сайте https://emedicine.medscape.com/article/2054430-overview. Доступ 28.07.19.

Альбумин, сыворотка. Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно на сайте https://endocrinology.testcatalog.org/show/ALB. Доступ 28.07.19.

(13 ноября 2018 г.) Моман Р.Н., Варакалло М. Физиология, Альбумин. StatPearls [Международный]. Остров сокровищ (Флорида): StatPearls Publishing; 2019. Доступно на сайте https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK459198/. Доступ 28.07.19.

Источники, использованные в предыдущих обзорах

Пагана, Кэтлин Д.И Пагана, Тимоти Дж. (2001). Справочник по диагностическим и лабораторным испытаниям Мосби, 5-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури.

Пагана, К. Д. и Пагана, Т. Дж. (© 2007). Справочник по диагностическим и лабораторным испытаниям Мосби, 8-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури. С. 775-780.

Кларк В. и Дюфур Д. Р., редакторы (© 2006). Современная практика клинической химии: AACC Press, Вашингтон, округ Колумбия. С. 197-198.

Ву, А. (© 2006). Клиническое руководство по лабораторным исследованиям Тиц, 4-е издание: Saunders Elsevier, St.Луи, Миссури. С. 66-71.

Dugdale, III, D. (Обновлено 23 февраля 2009 г.). Альбумин — сыворотка. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003480.htm. По состоянию на июнь 2009 г.

Шашидхар, Х. и Григсби, Д. (Обновлено 9 апреля 2009 г.). Недоедание. eMedicine [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/985140-overview. По состоянию на июнь 2009 г.

Peralta, R. et. al.(Обновлено 17 июня 2008 г.). Гипоальбуминемия. eMedicine Critical Care [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/166724-overview. Июнь 2009г.

(обновлено в декабре 2008 г.). Белки. ARUP Консультации [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.arupconsult.com/Topics/GastrointestinalDz/NutritionalAssessment/Proteins.html. По состоянию на июнь 2009 г.

Дагдейл, Д. (Обновлено 20 февраля 2011 г.). Альбумин — сыворотка. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003480.htm. По состоянию на январь 2013 г.

Дельгадо, Дж. (Обновлено в ноябре 2012 г.). Белки. ARUP Консультации [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.arupconsult.com/Topics/Proteins.html?client_ID=LTD. По состоянию на январь 2013 г.

Деварадж, С. (Обновлено 5 января 2012 г.). Альбумин. Справочник по Medscape [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/2054430-overview#showall. По состоянию на январь 2013 г.

(© 1995-2013). Альбумин, сыворотка. Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/8436. По состоянию на январь 2013 г.

Пагана, К. Д. и Пагана, Т. Дж. (© 2011). Справочник по диагностическим и лабораторным испытаниям Мосби, 10-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури. С. 799-804.

Кларк, У., редактор (© 2011). Современная практика в клинической химии, 2-е издание: AACC Press, Вашингтон, округ Колумбия.Стр. 234.

Макферсон Р. и Пинкус М. (© 2011). Клиническая диагностика и лечение Генри с помощью лабораторных методов 22-е издание: Elsevier Saunders, Филадельфия, Пенсильвания. Стр. 264-265.

Деварадж, С. (Обновлено 13 января 2015 г.). Альбумин. Наркотики и болезни, помогающие избежать болезней [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/2054430-overview. Дата обращения 23.03.16.

Lerma, E. et. al. (Обновлено 10 декабря 2015 г.). Протеинурия. Наркотики и болезни, помогающие избежать болезней [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/238158-overview. Дата обращения 23.03.16.

(© 1995–2016). Альбумин, сыворотка. Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/8436. Дата обращения 23.03.16.

Дельгадо, Дж. (Обновлено за декабрь 2015 г.). Белки. ARUP Консультации [Он-лайн информация]. Доступно на сайте https://arupconsult.com/content/proteins. Дата обращения 23.03.16.

(1 марта 2012 г.).Что такое альбумин мочи. Национальный институт диабета, болезней пищеварительной системы и почек [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.niddk.nih.gov/health-information/health-communication-programs/nkdep/learn/causes-kidney-disease/testing/understand-urine-albumin/Pages/understand-urine-albumin .aspx. Дата обращения 23.03.16.

Коэн, Э. и Липпольд, К. (обновлено 8 марта 2016 г.). Нефротический синдром. Наркотики и болезни, помогающие избежать болезней [Он-лайн информация]. Доступно на сайте http: // emedicine.medscape.com/article/244631-overview. Дата обращения 23.03.16.

Перальта Р. и Рубери Б. (Обновлено 1 апреля 2015 г.). Гипоальбуминемия. Наркотики и болезни, помогающие избежать болезней [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/166724-overview. Дата обращения 23.03.16.

Альбумин синтезируется в придатке яичка и объединяется в высокомолекулярный гликопротеиновый комплекс, участвующий в оплодотворении сперматозоидов и яйцеклеток

Abstract

Эпидидимис играет важную роль в созревании сперматозоидов для оплодотворения, но мало что известно о молекулах придатка яичка, участвующих в модификациях сперматозоидов во время этого процесса.Ранее мы описали паттерн экспрессии антигена в эпидидимальных эпителиальных клетках, который реагирует с моноклональным антителом (mAb) TRA 54. Иммуногистохимический и иммуноблоттинг-анализы предполагают, что эпитоп эпидидимального антигена, вероятно, включает сахарный фрагмент, который высвобождается в просвет придатка яичка. андроген-зависимым образом и впоследствии связывается со спермой в просвете просвета. С помощью колоночной хроматографии, SDS-PAGE с в расщеплении на месте и масс-спектрометрии мы идентифицировали белок, распознаваемый mAb TRA 54 в эпидидимальных эпителиальных клетках мыши.Белок ~ 65 кДа является частью высокомолекулярного комплекса (~ 260 кДа), который также присутствует в акросомальном пузырьке сперматозоида и полностью высвобождается после акросомной реакции. Аминокислотная последовательность белка соответствовала альбумину. Иммунопреципитаты с антителом против альбумина содержали антиген, распознаваемый mAb TRA 54, что указывает на то, что молекула придатка яичка, распознаваемая mAb TRA 54, является альбумином. ОТ-ПЦР выявила мРНК альбумина в придатке яичка и в анализах оплодотворения. в . vitro показало, что гликопротеиновый комплекс, содержащий альбумин, участвует в способности сперматозоидов распознавать и проникать в пеллюцидную оболочку яйца.Вместе эти результаты показывают, что происходящий из придатка яичник альбумин участвует в образовании высокомолекулярного гликопротеинового комплекса, который играет важную роль в оплодотворении яйцеклеток.

Образец цитирования: Arroteia KF, Barbieri MF, Souza GHMF, Tanaka H, ​​Eberlin MN, Hyslop S, et al. (2014) Альбумин синтезируется в придатке яичка и объединяется в гликопротеиновый комплекс с высокой молекулярной массой, участвующий в оплодотворении сперматозоидов. PLoS ONE 9 (8):
e103566.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0103566

Редактор: Владимир Н. Уверский, Медицинский колледж Университета Южной Флориды, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 29 октября 2013 г .; Одобрена: 2 июля 2014 г .; Опубликовано: 1 августа 2014 г.

Авторские права: © 2014 Arroteia et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: KFA и MFB были поддержаны стипендией PhD и MSc от Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES; http://www.capes.gov.br) и Conselho Nacional de Desenvolvgico Ecientnófico Cientnófico Cientnófico (CNPq; http://www.cnpq.br, номер гранта 130779 / 2012-1) соответственно. GHMFS был поддержан стипендией PhD от Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). MNE и SH были поддержаны исследовательскими стипендиями Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico (CNPq).Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; http://www.fapesp.br, номера грантов 01 / 12773-7, 01 / 00016-7 и 05 / 04007-3) и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Эпидидимис отвечает за концентрацию, транспортировку и хранение сперматозоидов, но также способствует созреванию путем добавления различных белков на поверхность сперматозоидов [1] — [3].Созревание сперматозоидов зависит от экспрессии и секреции белков и гликопротеинов эпидидимальным эпителием от головки к хвосту. Эти множественные и последовательные взаимодействия между поверхностью сперматозоидов и секретируемыми белками в просвете придатка яичка важны для способности сперматозоидов млекопитающих оплодотворять ооциты [4] — [8].

Использование моноклональных антител (mAb) для изучения молекул, экспрессируемых в мужских репродуктивных органах, способствовало нашему пониманию созревания сперматозоидов и формирования функциональной мужской гаметы [9] — [12].Ранее мы описали экспрессию новой тестикулярной (зародышевой клетки) [13] и эпидидимальной [14] молекулы с использованием mAb TRA 54 ( t эстикуляр r при антитело , полученное иммунизацией крыс зародышевыми клетками) [13] — [15]. Молекула, идентифицированная этим антителом, имеет высокую молекулярную массу (~ 260 кДа) и устойчива к обработке SDS / β-меркаптоэтанолом [13], [14]. Эпитоп антигена TRA 54, вероятно, содержит углеводные домены, судя по его чувствительности к периодату [13], [14].Иммуногистохимия показала, что TRA 54-реактивная молекула расположена в надъядерной цитоплазме эпидидимальных клеток головы, а также в просвете сперматозоидов. В целом, эти результаты предполагают, что молекула, распознаваемая mAb TRA 54, продуцируется и высвобождается эпидидимальными эпителиальными клетками, а затем связывается с поверхностью сперматозоидов, когда эти клетки движутся вниз по эпидидимальному протоку. Молекулы, распознаваемые mAb TRA 54 в эпидидимальных эпителиальных клетках, экспрессируются независимо от половых клеток семенников и продуцируются андроген-зависимым образом [14].

В этой работе мы использовали комбинацию колоночной хроматографии, SDS-PAGE с в расщеплении situ и масс-спектрометрии для идентификации белка, распознаваемого mAb TRA 54 в эпидидимальных эпителиальных клетках мыши. Поиск в базе данных и молекулярное моделирование использовались для идентификации белка, а анализы оплодотворения в vitro были использованы для изучения участия этого белка в оплодотворении яиц.

Материалы и методы

Животные

Самцов и самок мышей C57BL / 6 / JUnib (в возрасте 8 и 4 недель соответственно) содержали при 20–24 ° C в течение 12-часового цикла свет / темнота (свет включается при 6∶00 a.м.) со свободным доступом к воде и пище. Мышей умерщвляли шейным смещением, и их органы немедленно обрабатывали для последующих экспериментов.

Заявление об этике

Все эксперименты на животных были одобрены институциональным комитетом по этике экспериментов на животных (CEEA / UNICAMP, протокол № 590-1) и следовали этическим принципам Бразильского общества лабораторных исследований животных (SBCAL).

SDS-PAGE и иммуноблоттинг

Caput epididymis собирали у взрослых мышей C57BL / 6 и гомогенизировали в 1 мл 10 мМ трис-HCl, pH 7.4, содержащий 10 мМ ЭДТА (Маллинкродт, Париж, Франция), 100 мМ NaF, 10 мМ Na ₄ P ₂ O ₇ , 10 мМ Na ₃ PO ₄ , 2 мМ PMSF и 0,1 мг апротинина / мл (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Затем суспензии центрифугировали (10000 g, , 4 ° C, 15 мин), и полученный супернатант центрифугировали дважды (25000 g, 4 ° C, каждый раз по 25 минут). Концентрацию белка в супернатантах определяли с использованием набора для анализа белков Брэдфорда (Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США).Аликвоты каждого образца (100 мкг на дорожку) разводили в буфере для образцов и наносили на 10% полиакриламидные гели с последующим SDS-PAGE [16]. Затем белки были перенесены электрофоретически на поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны (Millipore, Bedford, MA, USA) для иммуноблоттинга с использованием mAb TRA 54 [13], [14] или pAb кроличьего антиальбуминового IgG (Abcam, Токио, Япония, ab34807). [17]. Иммуноблоттинг был выполнен для подтверждения картины распределения иммунореактивных полос в тканях перед хроматографией.Мембраны из ПВДФ блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в течение 1 ч, а затем промывали трис-буферным солевым раствором (150 мМ NaCl в 50 мМ Трис-HCl, pH 7,5), содержащим 0,05% Твин 20 (TBS-T). После инкубации с mAb TRA 54 (1-2 500 в TBS-T) или pAb кроличий антиальбуминовый IgG в течение ночи при 4 ° C, мембраны промывали TBS-T и инкубировали с козьим анти-крысиным IgG или козьим анти-кроличьим IgG. оба конъюгированы с пероксидазой (Dako A / S, Glostrup, Дания) в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительной промывки иммунореактивные полосы визуализировали с помощью набора для окрашивания ECLplus (Amersham).

Очистка 54-реактивного белка TRA

mAb TRA 54-реактивный антиген очищали из супернатантов эпидидимальных гомогенатов с помощью комбинации аффинной хроматографии и анионообменной хроматографии. Первоначально эпидидимальный супернатант загружали на колонку с сефарозой-конканавалином A (Con A) (HR 5/20; Amersham Biosciences, Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США), которая специфически связывает α-D-глюкопиранозил, α-D-маннопиранозил или стерически подобные остатки. Затем колонку промывали 0.1 М ацетат натрия, pH 6,0, содержащий 1 М NaCl, 1 мМ MgCl ₂ и 1 мМ CaCl ₂ . Связанные белки элюировали линейным градиентом глюкозы (0–0,5 М) в том же буфере. Профиль элюции белка контролировали путем измерения оптической плотности при 280 нм (хроматографическая система ÄKTApurifier10, Amersham Biosciences), и фракции объемом 1 мл собирали автоматически при скорости потока 1 мл / мин.

Полученные фракции проверяли на реактивность по отношению к mAb TRA 54 с помощью дот-блоттинга и / или иммуноблоттинга.Для дот-блоттинга фракции наносили на предварительно активированную нитроцеллюлозную мембрану (BioRad), и мембрану обрабатывали для иммунодетекции с использованием mAb TRA 54 [13], [14], по существу, как описано для иммуноблоттинга. Иммунореактивные фракции объединяли и концентрировали центрифугированием (4000 g , 4 ° C, 40 мин) на мембранах Amicon 5 кДа (Millipore) перед анионообменной хроматографией. Иммунореактивный пул, полученный на предыдущем этапе, наносили на высокопроизводительную колонку HiTrap Q Sepharose (Amersham Biosciences), предварительно уравновешенную 50 мМ трис-HCl, pH 7.4. Связанные белки элюировали линейным градиентом NaCl (0–1 М) в том же буфере. Фракции, которые прореагировали с mAb TRA 54 (оценка с помощью дот-блоттинга), были объединены с образованием трех пулов (A, B и C) на основе их профиля элюирования. Пулы концентрировали центрифугированием (4000 g, 4 ° C, 40 мин) на мембранах Amicon 5 кДа (Millipore) и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга с mAb TRA 54 для обнаружения иммунореактивных полос. Полосы белка в полиакриламидных гелях детектировали окрашиванием кумасси синим.

Гель для разложения трипсином in situ

Полоса, реагирующая с mAb TRA 54, обнаруженная в пуле А, была совместно локализована в геле, окрашенном кумасси синим, и вырезалась после обесцвечивания. Вырезанный фрагмент нарезали кубиками и суспендировали в 0,2 М растворе бикарбоната аммония, содержащем 45 мМ дитиотреитола (ДТТ), в течение 30 мин при 30 ° C. После центрифугирования и удаления супернатанта кусочки геля инкубировали с ацетонитрилом в течение 10 мин, а затем сушили в вакууме (скоростная вакуумная сушилка Module 3180C, Biotron, Puchon, Корея).Образец регидратировали в 10 мкл 45 мМ раствора бикарбоната аммония, содержащего 0,5 мкг бычьего трипсина (Sigma Aldrich), и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Пептиды, полученные в результате этого переваривания, экстрагировали из фрагментов геля путем двух инкубаций (по меньшей мере, 40 минут каждая) со 100 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в 60% ацетонитриле. За каждой инкубацией следовало центрифугирование с получением пептидсодержащего супернатанта, который удаляли и сушили роторным испарением [18].

Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии (МС)

Масс-спектры были получены с использованием матричной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) и времяпролетной (TOF) масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) и двумерной капиллярной жидкостной хроматографии (система CapLC, Waters, Манчестер, Великобритания) в сочетании к тандемному квадрупольному масс-спектрометру или гибридному масс-спектрометру -TOF с гексапольной ячейкой с индуцированной столкновением диссоциации (CID) (QTOF, Waters-Micromass, Манчестер, Великобритания) и источником нано-Z-спрея, оба работали в режиме положительных ионов.Анализатор TOF работал в режиме рефлектрона.

Массовый фингерпринт пептидов с помощью MS

Образцы, полученные триптическим расщеплением, были подготовлены для анализа методом высушенных капель [18], [19]. Вкратце, образцы подкисляли путем добавления 1 мкл 0,1% (об. / Об.) Трифторуксусной кислоты (TFA) в воду с последующей инкубацией в течение нескольких минут при комнатной температуре, чтобы уменьшить объем капель путем испарения в микропланшете MALDI. Матричный раствор 0,1% (мас. / Об.) Α-циано-4-гидроксикоричной кислоты готовили в растворе 0.В микропланшет добавляли 1% TFA с ацетонитрилом (1 ± 1, об. / Об.) И 1 мкл этого раствора. Образцу дали высохнуть при комнатной температуре. Все измерения были выполнены с помощью MALDI-TOF-MS. Последующую оценку данных и идентификацию пептидов проводили с использованием программного пакета Mascot Wizard (Matrix Science, Лондон, Великобритания; http://www.matrixscience.co.uk) [19].

Капиллярная жидкостная хроматография с обращенной фазой / масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS)

2D-LC-nano ESI-MS был выполнен с использованием прибора QTOF-1 и тройной насосной системы CapLC, подключенной через модуль клапана выбора потока к источнику nano Z-спрея.Образец вводили в систему через автоматический пробоотборник CapLC, используя режим ввода «микролитровый алгоритм захвата». Растворитель A состоял из 5% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте, растворитель B состоял из 95% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте, а растворитель C состоял из 0,1% муравьиной кислоты в H ₂ O. Белковый гидролизат предварительно концентрировали и обессоливали. на колонке-ловушке Waters Opti-Pak C ₁₈ и подключенной к насосу C через модуль клапана выбора потока. Этап предварительного концентрирования / обессоливания проводился при 5 мкл / мин в течение 20 минут с использованием насоса C.После переключения на насосы A и B к картриджу предколонки применяли градиент, который затем использовали для элюирования образца из капиллярной колонки (NanoEase; внутренний диаметр 75 мкм × 15 см), заполненной смолой C ₁₈ (Waters). Колонку уравновешивали 5% растворителем B, и линейный градиент этого растворителя (от 5% до 70%) применяли в течение 60 мин (200 нл / мин) с использованием предварительного разделения колонки с насосом, доставляющим 15 мкл / мин. мин. Анализ NanoESI-MS в диапазоне m / z от 300 до 2000 был проведен на линии с капиллярным хроматографическим разделением триптических гидролизатов алкилированного белка при скорости сканирования 1 с / сканирование.Сбор данных, зависящий от данных (DDA), проводился параллельно с капиллярным хроматографическим разделением только для триптического гидролизата алкилированного белка. Первоначальный обзор nanoESI-MS был получен в диапазоне m / z 300–2000 каждую секунду, с критериями переключения для МС на МС / МС, которые включали интенсивность ионов и состояние заряда. Данные NanoESI-MS / MS были получены в диапазоне m / z 50–2000 каждую секунду для до трех совместно элюируемых пептидов, но только для двух- и трехзарядных ионов. Переключение обратно из режима nanoESI-MS / MS в режим nanoESI-MS было разрешено через 10 с.Используемая энергия столкновения автоматически изменялась в соответствии с отношением m / z элюируемых пептидов.

Секвенирование пептидов с помощью LC-nanoESI-MS / MS

Используемые условия ионизации включали капиллярное напряжение 2,8 кВ и напряжения конуса и линзы RF1 30 В и 100 В соответственно. Температура источника составляла 80 ° C, а газ в конусе был N ₂ при 0,15 бар. Для диссоциации ионов в гексапольной ячейке столкновений использовался аргон. Внешняя калибровка с использованием [Glu] -Fib (Sigma-Aldrich F-3261) проводилась во всем диапазоне m / z 50–2000.Все масс-спектры были получены с помощью анализатора TOF в «V-режиме» рефлектрона (TOF кВ = 7,2), а напряжение MCP было установлено на 2100 В.

De novo секвенирование триптических пептидов

Алкилированные триптические пептиды, разделенные обращенно-фазовой капиллярной хроматографией, лиофилизировали и ресуспендировали в 20% ацетонитриле в 0,1% муравьиной кислоте перед инъекцией в источник масс-спектрометра при скорости потока 100 нл / мин. Полученные в результате масс-спектры ионов-продуктов были получены с использованием анализатора TOF и деконволютированы с использованием алгоритма MaxEnt3.Данные МС / МС для однозарядных ионов обрабатывали вручную с помощью приложения PepSeq, входящего в программный пакет MassLynx. Данные nanoESI-MS / MS были обработаны с использованием программного обеспечения ProteinLynxGlobalServer v. 2.0.5 для выходных файлов, созданных с помощью пик-листа (pkl), и модуля Mascot MS / MS Ion Search (http://www.matrixscience.co.uk ).

Компьютерное выравнивание последовательностей триптических пептидов

Последовательности триптических пептидов были автоматически выровнены Mascot (http: // www.matrixscience.co.uk) с использованием схемы оценки MOWSE. Инструмент анализа пептидных отпечатков пальцев Mascot включает вероятностную реализацию алгоритма MOWSE, который точно моделирует протеолитическое поведение и специфичность трипсина. После оценки данных, сгенерированных выходными файлами в Mascot, все пептиды были использованы для поиска в банке данных совпадающих белков с последующим выравниванием с белком, который показал наилучшие оценки вероятности на основе MOWSE [20].

Поиск сходства аминокислотной последовательности

Для сравнения аминокислотной последовательности, полученной в предыдущем разделе, с последовательностями, доступными на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov).

Анализ иммунопреципитации

pAb кроличий антиальбуминовый IgG (Abcam, Токио, Япония; ab34807) [17] или mAb TRA 54 (Abcam, Токио, Япония) [13], [14] добавляли к Dynabeads-белку G (Invitrogen, Tokyo, Япония), трижды промывали промывочным буфером и поперечно сшивали диметилпимелимидатным (DMP) буфером с последующими тремя дополнительными промываниями 25 мМ цитрат / 52 мМ фосфатного буфера (pH 5,0) в соответствии с инструкциями производителя перед хранением при 4 ° C.Эпидидимис головного мозга гомогенизировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,5 М сахароза, 1% декстран, 5 мМ MgCl ₂ ), содержащем ингибиторы протеаз — 1 мМ ЭДТА и антипаин, лейпептин и пепстатин А (3 мкг / мл каждый). Лизаты центрифугировали (200 г , 4 ° C, 10 мин) и Dynabeads-protein G инкубировали с 2,9 мг супернатантного белка в течение 40 минут при 25 ° C с последующими четырьмя промываниями цитрат-фосфатным буфером (pH 5,0). в соответствии с инструкциями производителя. Буфер для элюирования (0.1 М цитрат натрия, pH 3,1) добавляли к Dynabeads-протеину G, и затем образцы анализировали вестерн-блоттингом. Концентрацию белка в каждой фракции оценивали на основе поглощения при 280 нм, используя бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве стандарта. Затем 50 мкг белка из каждой фракции подвергали SDS-PAGE с последующим электроблоттингом на поливинилидендифторидной (PVDF) мембране (Millipore). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали в течение 15 минут при комнатной температуре TBS (100 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl), содержащего 0,1% твин-20, и затем инкубировали с mAb TRA 54 [13], [14] или козьим pAb против N-конца альбумина (Santa Cruz Biotechnology Inc., TX, США; sc- 46291) в течение ночи при 4 ° C в растворе иммуноокрашивания Can Get Signal (Toyobo, Осака, Япония). Затем мембраны промывали в PBS, содержащем Tween 20, в течение 3 минут с последующими тремя промывками по 5 минут перед инкубацией с конъюгированными с пероксидазой иммуноглобулинами крысы (1-2 500; Invitrogen) в течение 1 часа при 25 ° C. После дополнительной промывки иммунореактивные полосы визуализировали с помощью набора для окрашивания ECLplus (Amersham).

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)

Суммарную РНК экстрагировали из семенников, всего придатка яичка и придатков яичка (начальный сегмент, головная часть, тело и хвост) с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Мэриленд, США) с последующей обработкой ДНКазой I (Invitrogen, Мэриленд, США) для удаления контаминирующих геномных клеток. ДНК. кДНК синтезировали с использованием SuperScript III RNaseH — обратной транскриптазы и олиго dT12-18 в качестве праймера. Прямой и обратный праймеры альбумина для ПЦР были: 5′-ATGAAGTGGGTAACCTTTCTCC-3 ‘и 5′-GGATGTCTTCTGGCAACTTC-3’ соответственно.Реакции проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 2 мкл кДНК, 10 пмоль праймеров, 0,2 мМ dNTP, 1,5 мМ MgCl ₂ , 1X буфер для ПЦР, 2,5% DMSO и 1 ЕД ДНК-полимеразы Taq (LGC Биотехнология, Лондон, Великобритания). Условия ПЦР состояли из начальной денатурации при 95 ° C в течение 1 минуты, затем следовали пять циклов 95 ° C в течение 30 с, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 2 минут и 30 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд. с, 55 ° C в течение 30 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд. Окончательное удлинение проводили при 72 ° C в течение 10 мин.Один микролитр каждого образца ПЦР подвергали электрофорезу в 3% агарозном геле, окрашивали бромидом этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Целостность и качество общей кДНК проверяли с помощью ОТ-ПЦР гена домашнего хозяйства циклофилина. Идентичность альбуминового продукта ПЦР подтверждали нуклеотидным секвенированием (анализатор ДНК ABI 3730), а размер полученного фрагмента определяли расщеплением с использованием рестрикционного фермента Hinf I (Fermentas Life Science, Берлингтон, Онтарио, Канада).Волокнистый хрящ (хвост мыши) использовали в качестве отрицательного контроля, а экстракт печени — в качестве положительного контроля. Реакции были выполнены в трех экземплярах.

Иммунолокализация и судьба антигена TRA 54 во время акросомной реакции

Свежие сперматозоиды выдавливали из семявыносящего протока мыши в среду M16 (Sigma Aldrich) с добавлением 4 мг BSA / мл. Для капситации сперматозоиды инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ , а затем осаждали центрифугированием (400 г , 10 мин) в забуференном фосфатом солевом растворе Дульбекко (Dulbecco’s PBS; Gibco). .Чтобы вызвать акросомную реакцию, конденсированные сперматозоиды ресуспендировали в растворе, содержащем ионофор кальция A23187 (30 нМ), в течение 20 минут [21], а затем трижды промывали в PBS Дульбекко путем центрифугирования (400 г , 10 минут). Для иммуногистохимического анализа образцы 5 мкл конденсированных и прореагировавших на акросомы сперматозоидов сушили на предметных стеклах и фиксировали ледяным метанолом в течение 30 минут перед иммуноокрашиванием mAb TRA 54, как описано ранее [13], [14], с небольшим модификации.Вкратце, неспецифические сайты связывания блокировали 20% нормальной козьей сывороткой. Предметные стекла с капситированными или прореагировавшими на акросомы спермой впоследствии инкубировали в течение ночи с асцитной жидкостью mAb TRA 54 (разведенной 1-4000 в PBS / 1% BSA) с последующей инкубацией с биотинилированным вторичным антителом против крыс и обнаружением с помощью набора Strept ABC ( оба от DAKO A / S, Глоструп, Дания). Реакция развивалась с перекисью водорода и диаминобензидином. Контрольные срезы обрабатывали аналогично, но без mAb TRA 54.Чтобы оценить состояние акросомы, предметные стекла, содержащие сперматозоиды или сперматозоиды, прореагировавшие на акросомы, были помечены FITC-конъюгированным лектином агглютинина арахиса (FITC-PNA) [22], [23]. Сперматозоиды, не показавшие маркировки, считались прошедшими полную акросомную реакцию [24]. Полученные препараты исследовали с помощью флуоресцентной или фазово-контрастной микроскопии с использованием микроскопа Nikon (Nikon, Токио, Япония).

Иммунозолото-мечение сперматозоидов с помощью mAb TRA 54

Емкостные сперматозоиды или сперматозоиды, подвергшиеся акросомной реакции, трижды промывали PBS осторожным центрифугированием и фиксировали в 1 мл 4% параформальдегида и 0.2% глутаральдегид в 0,1 М буфере какодилата натрия, pH 7,4, при 4 ° C в течение 1 часа. Затем образцы трижды промывали 0,05 М трис-HCl, pH 7,4, дегидратировали в градуированной серии N-N-диметилформамида и заливали смолой LR-White при -20 ° C в течение 48 часов для обеспечения полной полимеризации. Ультратонкие срезы (100 нм) собирали на никелевые сетки, промывали в течение 5 мин в 0,05 М трис-HCl, pH 7,4 и предварительно инкубировали в течение 30 минут с 0,05 М трис-HCl, pH 7,4, содержащим 1% БСА. Затем сетки инкубировали в течение ночи при 4 ° C с mAb TRA 54 (разведенным 1–3000) с последующей промывкой 0.05 M трис-HCl, pH 7,4, и инкубация в течение 1 часа с козьими вторичными антителами против крыс, конъюгированными с частицами золота (диаметром 15 нм) (Dako A / S). Срезы окрашивали уранилацетатом. Контрольные реакции с мечением золотом проводили, пропуская инкубацию с mAb TRA 54.

Влияние TRA 54-реактивного белка на акросомную реакцию

Сперма из семявыносящего протока разделяли на четыре группы (I, II, III и IV) и инкубировали в M16-BSA в течение 2 часов при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ (12 определений на группу).Сперма в группе I инкубировали только с M16-BSA, группу II инкубировали с 1% mAb TRA 54 [13], [14], группу III инкубировали с 1 мкМ ионофором кальция A23187, а группу IV обрабатывали обоими mAb TRA 54. и ионофор кальция (антитело добавляли перед ионофором). Акросомный статус сперматозоидов оценивали с помощью FITC-PNA [22], [23]. Процент сперматозоидов с интактными акросомами или прошедших акросомную реакцию в каждой группе определяли с помощью флуоресцентной микроскопии (возбуждение при 494 нм; испускание при 520 нм).Считалось, что сперматозоиды с отрицательной флуоресценцией полностью прореагировали на акросомы [24]. Для статистического анализа было подсчитано не менее 400 сперматозоидов при каждом состоянии или лечении.

In vitro Анализы оплодотворения

Самок мышей (возрастом 4 недели) суперовулировали путем последовательных внутрибрюшинных инъекций 5 МЕ хорионического гонадотропина лошади (eCG; Syntex SA, Сан-Паулу, SP, Бразилия) и 48 ч спустя 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ; Calier, Барселона, Испания).Стимулированных самок спаривали с самцами после вазэктомии после введения ХГЧ. Овулированные ооциты собирали путем разрыва ампул яйцевода через 20 ч после введения ХГЧ. Ооциты немедленно переносили в культуральную среду M2, предварительно уравновешенную при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ . Комплексы кумулюсов удаляли из ооцитов кратковременной обработкой 0,01% гиалуронидазы в M2 [25]. Некоторые ооциты, свободные от кумулюсов, кратковременно инкубировали с раствором Тирода с низким pH (2,5) [26], чтобы удалить zona pellucida (свободные ооциты zona pellucida).Ооциты zona pellucida-intact и zona pellucida-free переносили в капли среды M16-BSA в 35 мм чашки Falcon под минеральным маслом. Для оплодотворения конденсированные или прореагировавшие на акросомы сперматозоиды, полученные обработкой ионофором кальция A23187 [27] в наномолярной концентрации, были распределены по трем образцам: контрольная группа I — инкубировалась в течение 3 часов в одной среде M16-BSA, контрольная группа II — инкубировалась. в среде, содержащей 10% нормальной кроличьей сыворотки, а тестовую группу — инкубировали в среде, содержащей 10% mAb TRA 54.Конечную концентрацию сперматозоидов доводили до 2 × 10 ⁶ сперматозоидов / мл в 60 мкл капле среды. Ооциты с неповрежденной zona pellucida инкубировали совместно с емкостными сперматозоидами, а ооциты без zona pellucida совместно инкубировали со сперматозоидами, прореагировавшими на акросомы. После 5 ч совместной инкубации при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ ооциты и прилипшие сперматозоиды переносили в свежую каплю среды. Оплодотворение оценивали с помощью инвертированного микроскопа на основании присутствия двух клеток через 24 часа совместной инкубации гамет.Каждую пробу проводили 6–12 раз.

Статистический анализ

Числовые данные для акросомного статуса сперматозоидов были выражены в виде среднего значения ± SEM и были проанализированы статистически с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки с p <0,05, указывающим на значимость. Результаты анализов ЭКО были проанализированы с использованием критерия хи-квадрат (χ ² ) со значением p <0,01, указывающим на значимость после применения поправки Бонферрони для множественных сравнений.

результатов

Обнаружение иммунореактивного высокомолекулярного комплекса TRA 54 в придатке яичка головы

Вестерн-блотов экстрактов C57 BL / 6 caput эпидидимиса выявили полосу ~ 260 кДа, которая реагировала с mAb TRA 54 (фиг. 1).

Рисунок 1. Иммуноблоты экстрактов придатка яичка мыши.

Аликвоты (50 мкг) белка подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле и переносили на PVDF-мембрану для иммуноблоттинга с mAb TRA 54 или кроличьим антиальбумином pAb (Abcam, Tokyo, Japan, ab34807).Стрелки указывают верхний (mAb TRA 54) и нижний (pAb антиальбумин) пределы белковых комплексов, обнаруженных в образцах. Контроль 1 представляет собой иммуноблот без mAb TRA 54, а контроль 2 представляет собой экстракт почек, иммуноблотированный с mAb TRA 54. Иммунореактивные полосы не были обнаружены ни в одном из этих контролей. Слева показаны маркеры молекулярной массы (ММ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103566.g001

Очистка эпидидимального белка, распознаваемого mAb TRA 54

Аффинная (Con A) хроматография гомогенатов придатка яичка дала два пика несвязанного материала, из которых только фракции (пробирки) 1 и 2 первого пика реагировали с mAb TRA 54; Никакие дополнительные белки не элюировались градиентом глюкозы, что указывает на то, что в этих условиях взаимодействие белка с колонкой было слабым (рис.2А, Б). Последующая анионообменная хроматография положительных фракций (рис. 2C) с последующим дот-блот-анализом позволила идентифицировать три иммунореактивные группы: фракции 35–38, 39–43 и 44–50, которые были объединены в пулы A, B и C соответственно (рис. 2С, Г). SDS-PAGE (фиг. 3A) и иммуноблоттинг (фиг. 3B) пула A показали полосу ~ 65 кДа, которая сильно реагировала с mAb TRA 54; эта полоса не была обнаружена в пулах B и C. Полоса белка, соответствующая иммунореактивной полосе в пуле A, вырезалась из геля, окрашенного синим Коммасси, для последующего переваривания трипсином.

Фигура 2. Частичная очистка эпидидимального белка мыши, обнаруженного с помощью mAb TRA 54.

A) Фракционирование гомогената ткани головки придатка яичка на колонке с сефарозой-конканавалином A (Con-A). После промывки колонки 0,1 М ацетатом натрия, pH 6,0, содержащим 1 М NaCl, 1 мМ MgCl ₂ и 1 мМ CaCl ₂ , колонку элюировали линейным градиентом (0–0,5 М) глюкозы в этом растворе. тот же буфер. Обратите внимание, что два пика (I и II) элюировались во время промывки колонки, и никакие белки не элюировались градиентом глюкозы.B) Дот-блоттинг фракций, соответствующих пикам I и II, показал, что только фракции 1 и 2 пика I реагировали с mAb TRA 54. Эти фракции были объединены и дополнительно очищены с помощью анионообменной хроматографии (высокоэффективная колонка HiTrap Q-Sepharose. ). C) Профиль элюирования иммунореактивных фракций 1 и 2 (из пика I стадии сефарозы-Con A) после ионообменной хроматографии. Связанные белки элюировали линейным градиентом NaCl (0–1 М) в 50 мМ трис-HCl, pH 7,4. D) Дот-блот выявил несколько фракций, которые реагировали с mAb TRA 54.Положительные фракции объединяли в три пула (пул A: фракции 35–38; пул B: фракции 39–43; пул C: фракции 44–50), которые впоследствии анализировали с помощью электрофореза и иммуноблоттинга.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103566.g002

Рис. 3. SDS-PAGE и иммуноблоттинг очищенного эпидидимального белка мыши.

Аликвоты (100 мкг) иммунореактивных пулов A, B и C, полученные с помощью ионообменной хроматографии и экстрактов придатка яичка, подвергали электрофорезу в 7.5% полиакриламидный гель (A) и перенесенный на PVDF-мембрану для иммуноблоттинга с mAb TRA 54 (B). Сильно иммунореактивная полоса ~ 65 кДа была обнаружена в пуле A (стрелка на панели B), но не в пулах B и C. Соответствующая полоса белка в полиакриламидном геле, окрашенном синим коммасси (стрелка на панели A), была вырезана, и белок переваривается трипсином. Контрольные иммуноблоты без mAb TRA 54 не показали полос (не показаны). ММ — маркеры молекулярной массы.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0103566.g003

Идентификация TRA 54-реактивного эпидидимального белка как альбумина на основе секвенирования пептидов с помощью масс-спектроскопии (МС) и иммунопреципитации

Триптические пептиды очищенной белковой полосы были обнаружены с помощью MALDI-TOF-MS и секвенированы с помощью LC-nanoESI-MS / MS. Инкубация очищенного белка с трипсином дала 17 пептидов для массового фингерпринтинга пептидов и 15 пептидов для секвенирования de novo по спектрам MS / MS.Последующие поиски в базах данных NCBI с использованием триптических пептидных последовательностей дали точные совпадения с мышиным альбумином-1, основным циркулирующим белком в крови. На рисунке S1 сравнивается последовательность этого белка с мышиным альбумином-1. Последовательность белка депонирована в базе знаний UniProt под номером доступа P07724.

Чтобы подтвердить, что альбумин был антигеном, который реагировал с mAb TRA 54, иммуноблоттинг с mAb TRA 54 был проведен после иммунопреципитации белков из придатка яичка головы с помощью антиальбуминового антитела pAb IgG или mAb TRA 54, поперечно сшитого с Dynabeads-протеином G.Иммунопреципитаты, полученные из придатка яичка, полученные с помощью антитела против альбумина pAb и зондированные с помощью mAb TRA 54, привели к обнаружению TRA 54-реактивного белка (~ 260 кДа), дополнительно подтверждая, что молекула придатка яичка, распознаваемая mAb TRA 54, содержала альбумин ( Рис.4, дорожка 3). Иммунопреципитаты, полученные из придатка яичка с использованием антиальбуминового pAb и зондированные козьим pAb против N-конца альбумина, включали обнаружение 54-реактивного белка TRA (~ 260 кДа) и фракции ~ 65 кДа, что дополнительно подтверждает идентификацию. альбумина в составе высокомолекулярного комплекса (рис.4, дорожка 4). Кроме того, слабая иммунореактивная полоса наблюдалась при ~ 260 кДа, когда иммунопреципитация и иммуноблоттинг проводились с mAb TRA 54 (фиг. 4, дорожка 6).

Рисунок 4. Идентификация mAb TRA 54 и pAb антиальбумин-реактивного белка в придатке яичка мыши с помощью иммунопреципитации с последующим иммуноблоттингом.

Обнаружение TRA 54-реактивного белка в гомогенатах головного придатка яичка. Загружали аликвоты (50 мкг) гомогената (дорожка 1). Иммунопреципитат (IP), полученный с IgG, зондировали (IB) с помощью mAb TRA 54 (дорожка 2).Иммунопреципитат, полученный с pAb кроличьим антиальбумином (AA) IgG (Abcam; ab34807), зондировали с помощью mAb TRA 54 (дорожка 3) или козьего pAb против N-конца альбумина (Santa Cruz Biotechnology; sc-46291) (дорожка 4). Иммунопреципитат, полученный с mAb TRA 54, исследовали с помощью кроличьего антиальбуминового IgG (Abcam; ab34807) (дорожка 5) и mAb TRA 54 (дорожка 6). Для иммунопреципитации использовали Dynabeads-protein G (Veritas, Tokyo, Japan) в соответствии с рекомендациями производителя. Стрелки указывают сигналы.Слева указаны маркеры молекулярной массы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103566.g004

мРНК альбумина синтезируется эпидидимальными и тестикулярными клетками

ОТ-ПЦР показала, что мРНК альбумина транскрибируется в яичках и придатках яичка, включая все его области (рис. 5А). Экспрессия гена домашнего хозяйства циклофилина подтвердила неповрежденность кДНК (фиг. 5B). Нуклеотидные последовательности (BankIt1558664, 1562898 и 1562932) и профиль переваривания рестриктазами подтвердили, что продукт ПЦР является альбумином (рис.5С).

Рисунок 5. Транскрипты мРНК альбумина, обнаруженные с помощью ОТ-ПЦР.

(A) ОТ-ПЦР выявила мРНК альбумина в семенниках и придатках яичка мыши (и во всех их областях). В этих анализах печень мыши использовали в качестве положительного контроля, а волокнистый хрящ из хвоста мыши использовали в качестве отрицательного контроля. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 3% агарозных гелях и включали лестницу ДНК размером 100 п.н. (B) Ген домашнего хозяйства использовали для проверки целостности и качества общей кДНК.Прямой и обратный праймеры для ПЦР были: 5′-CTTGCTGCAGACATGGTC-3 ‘и 5′-GCAATCCTGCTAGACTTG-3’ соответственно. Бланк использовали в качестве контрольной реакции RT-PCR. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 3% агарозных гелях и включали лестницу ДНК размером 100 п.н. (C) Размер фрагмента ПЦР альбумина подтверждали перевариванием с использованием рестрикционного фермента HinfI. Фрагменты переваривания анализировали электрофорезом в 3% агарозных гелях и включали лестницу ДНК размером 100 п.н.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0103566.g005

Высокомолекулярный гликопротеиновый комплекс, содержащий альбумин, присутствует в акросоме сперматозоидов

Интактные сперматозоиды, меченные FITC-PNA, не показали акросомной реакции (фиг. 6A). Акросомная область, но не жгутик или другие области сперматозоидов, содержали антиген TRA 54 (фиг. 6B). Считалось, что сперматозоиды без флуоресцентного окрашивания подверглись полной акросомной реакции (фиг. 6C), и в этих клетках не наблюдалось положительной реакции на mAb TRA 54 (фиг.6D). Просвечивающая электронная микроскопия препаратов, меченных иммунным золотом, показала положительную реакцию на mAb TRA 54 в плазматической мембране, окружающей головку сперматозоида, и в акросоме (фиг. 6E). Сперма, прореагировавшая на акросомы, не показала положительного мечения mAb TRA 54 (фиг. 6F).

Рисунок 6. Экспрессия антигена TRA 54 в сперматозоидах на основе иммунореактивности с mAb TRA 54.

Целостность акросомы сперматозоидов оценивали по присутствию (стрелка в A) или отсутствию (C) флуоресцентной области FITC-PNA. в головке сперматозоида.Антиген TRA 54 был обнаружен в акросоме в конденсированных и интактных сперматозоидах (стрелка в B), но не был обнаружен после акросомной реакции (D). Жгутик сперматозоидов не был помечен (B). (E, F) Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) сперматозоидов, иммуномеченных mAb TRA 54. (E) Положительная реакция (частицы золота) в плазматической мембране, покрывающей головку сперматозоида, и в акросоме (Ac) конденсированных сперматозоидов. (F) Антиген TRA 54 не был обнаружен в сперматозоидах, прореагировавших на акросомы. N — ядро. Панели (A) и (C) — флуоресцентные изображения, (B) и (D) — изображения с фазовым контрастом, а (E) и (F) — изображения TEM.Обратите внимание, что изображения на панелях (A) и (B), а также на панелях (C) и (D) сделаны из тех же препаратов, но с разным освещением. Масштабные линейки: A – D –3,5 мкм, E – 0,2 мкм, F – 0,35 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103566.g006

Высокомолекулярный гликопротеиновый комплекс, содержащий альбумин, участвует в проникновении сперматозоидов в блестящую оболочку.

Предварительное добавление mAb TRA 54 к сперматозоидам не изменяло скорость акросомной реакции на ионофор кальция A23187 (рис.7). Когда zona pellucida-интактные ооциты использовались для анализов оплодотворения in vitro , частота оплодотворения составила 83,9% (n = 47 из 56) в контрольной группе и 83,7% (n = 41/49) в группе, получавшей нормального кролика. сыворотки (контрольные группы I и II соответственно; χ 90 · 106 2 = 0,001; p = 0,97), но только 30,2% (n = 16/53), когда добавляли mAb TRA 54 (тестовая группа) (χ 90 · 106 2 = 32,24). , p <0,0001 для тестовой группы по сравнению с контрольной группой I; χ ² = 29,54, p <0,0005 для тестовой группы по сравнению с контрольной группой II).

Фигура 7. Влияние mAb TRA 54 на акросомную реакцию, индуцированную ионофором кальция A23187.

Группа I — контрольная сперма, группа II — mAb TRA 54, добавленная к сперматозоиду, группа III — ионофор кальция, добавленный к сперматозоиду, и группа IV — mAb TRA 54, добавленная к сперме перед ионофором кальция. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 12 определений / образец). Значения с разными буквами достоверно различались (F = 119, 3; p <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103566.g007

Сперма в трех группах (контрольная группа I, контрольная группа II и опытная группа) в равной степени была способна оплодотворять ооциты, свободные от zona pellucida, поскольку частота оплодотворения составила 86,9% (n = 53/61), 81,3 % (n = 26/32) и 83,1% (n = 49/59), соответственно (χ ² = 0,52, p = 0,47 для контрольной группы I по сравнению с контрольной группой II; χ ² = 0,35, p = 0,56 для тестовой группы по сравнению с контрольной группой I и χ ² = 0,05, p = 0,83 для тестовой группы по сравнению с контрольной группой II).

Обсуждение

Некоторые молекулы, секретируемые в придаточную жидкость, вносят вклад в поверхностные модификации, участвующие в созревании сперматозоидов [1] — [5]. Ранее мы описали эпидидимальную молекулу, распознаваемую mAb TRA 54, которая, по-видимому, высвобождается из эпидидимальных эпителиальных клеток и впоследствии прикрепляется к просвету сперматозоидов [14]. Своеобразный паттерн экспрессии этого белка предполагает, что, помимо других возможных функций [13], эта молекула может участвовать в распознавании сперматозоидов или проникновении в яйцеклетки.В настоящем исследовании мы стремились идентифицировать эпидидимальный белок, участвующий в реактивности с mAb TRA 54, и исследовать его возможное участие в оплодотворении.

Используя комбинацию аффинной (лектин) и анионообменной хроматографии, SDS-PAGE с при расщеплении на месте , масс-спектрометрии и иммунодетекции (дот-блоттинг и вестерн-блоттинг) мы идентифицировали белок ∼65 кДа, который реагировал с mAb TRA. 54. Любопытно, что основная иммунореактивная полоса mAb TRA 54 гомогенатов придатка яичка имела молекулярную массу ~ 260 кДа, что значительно отличается от ~ 65 кДа, обнаруженного для изолированного эпидидимального белка.Эта разница в размере позволяет предположить, что выделенная молекула, распознаваемая mAb TRA 54, является частью устойчивого к SDS / β-мекаптоэтанолу комплекса с более высокой молекулярной массой, который может содержать более одного типа белка или может быть модифицирован добавлением олигосахаридных цепей. Мы предполагаем, что белковый комплекс ∼260 кДа подвергся диссоциации во время очистки, как это наблюдалось для других белковых комплексов [28]. Присутствие гликозидных компонентов в молекулярном комплексе, распознаваемом mAb TRA 54 [13] — [15], может способствовать образованию молекулярных агрегатов, обычно обнаруживаемых в просвете придатка яичка [4], [29] — [32] и в сперматозоидах. акросома [24].

Масс-спектрометрический анализ эпидидимального белка, распознаваемого mAb TRA 54 и его триптических фрагментов методами MALDI-TOF-MS и 2D-LC-nanoESI-MS / MS, соответственно, дал молекулярную массу 64 961 Да, что соответствует ∼65 кДа первоначально оценивалась с помощью SDS-PAGE. Сравнение полученных здесь пептидных последовательностей с последовательностями в базе данных NCBI выявило соответствие между эпидидимальным белком, распознаваемым mAb TRA 54, и мышиным альбумином-1.

Иммунопреципитаты гомогенатов придатка яичка с использованием антиальбуминового pAb IgG включали молекулу, распознаваемую mAb TRA 54.Это открытие подтвердило, что высокомолекулярный комплекс, идентифицированный mAb TRA 54, включает альбумин и, возможно, другие белковые или гликозидные компоненты.

Присутствие альбуминоидных белков в придатке яичка было описано другими [29], [33], которые идентифицировали преальбуминные эпидидимальные белки (PES) как класс эпидидимальных белков, характеризующихся наличием структурных доменов, связанных с альбумином. области [28], [34]. Изоформы PES были идентифицированы в тканях овцы [28], барана [34], [35] и крысы [33], [36], [37].Dacheux et al. [38] обнаружил альбумин в придатке яичка человека, но этот белок считался компонентом сыворотки, а не молекулой, синтезируемой эпидидимальным эпителием. Чтобы выяснить, действительно ли яички и придатки яичка являются участками биосинтеза альбумина (в отличие от того, что они являются компонентом комплекса сыворотки, транспортируемым в эти органы), мы оценили экспрессию гена альбумина в обоих органах с помощью ОТ-ПЦР. Наши результаты подтвердили, что мРНК альбумина синтезируется тестикулярными клетками [39], но также предоставили первые доказательства экспрессии гена альбумина в эпидидимальных клетках, т.е.е., этот ген экспрессируется в этих двух органах у взрослых мышей. Несмотря на свидетельства того, что альбумин экспрессируется в придатковой ткани [33], [34], никакие предыдущие работы не показали, что альбумин действительно синтезируется эпидидимальными клетками. Четыре области придатка яичка экспрессируют ген альбумина, что указывает на то, что весь придаток яичка и, следовательно, все стадии созревания сперматозоидов могут зависеть от высокомолекулярного гликопротеинового комплекса, содержащего альбумин, или модулироваться им. Это открытие особенно интересно, поскольку, помимо классических сайтов экспрессии альбумина (таких как печень и желточный мешок [40], [41]), в последние годы были описаны новые сайты транскрипции мРНК альбумина, включая молочную железу. , язык, кишечник, лимфатический узел, семенники и матка крупного рогатого скота [39], [42], а также мозг [43] человека.

В мужском репродуктивном тракте альбумин может участвовать в транспорте других молекул к мембране сперматозоидов во время созревания придатка яичка, в перемещении белков во время акросомной реакции или в ремоделировании мембраны во время слияния мембран сперматозоидов и ооцитов [36]. Эпидидимальный альбумин также может быть ответственным за сборку (глико) белкового комплекса, распознаваемого mAb TRA 54. Кроме того, эпидидимальный альбумин-содержащий белковый комплекс может абсорбироваться акросомой сперматозоидов, как это происходит с другими секретируемыми эпидидимом белками [24].Хотя для запуска акросомной реакции не требуется высокомолекулярный комплекс, этот комплекс постепенно диспергируется и полностью экзоцитозируется во время реакции. Это поступательное движение белков может включать альбумин в качестве молекулы-носителя.

У крыс белки PES высвобождаются из придатка яичка тестостерон-зависимым образом, они могут связываться с мембраной сперматозоидов, когда эти клетки проходят через просвет придатка яичка [14], [28], [29], [33], [44]. ] и может участвовать в связывании сперматозоидов с блестящей оболочкой [36].Мы предполагаем, что тот же образец синтеза и функции может применяться к комплексу, распознаваемому mAb TRA 54 [13], [14], и что, помимо эпидидимального PES, эпидидимальный альбумин может играть важную роль в оплодотворении после экзоцитоза альбумина. -содержащий комплекс при акросомальной реакции.

В соответствии с этим предположением, в экспериментах по оплодотворению vitro , описанных здесь, показали, что добавление mAb TRA 54 к среде для оплодотворения значительно ингибировало скорость оплодотворения интактных ооцитов zona pellucida, но не влияло на эту скорость в zona pellucida -свободные ооциты.В совокупности эти данные указывают на то, что высокомолекулярный комплекс придатка яичка, содержащий альбумин, участвует в оптимизации проникновения в блестящую оболочку спермой, реагирующей на акросомы. Кроме того, эпидидимальный альбумин может способствовать транспортировке и связыванию других молекул и ферментов, которые становятся прочно связанными с поверхностью сперматозоидов и необходимы для вторичного связывания сперматозоидов с мембраной ооцита [24], [44], [45].

В заключение, мы идентифицировали высокомолекулярный комплекс, содержащий альбумин, в гомогенатах головки придатка яичка.Кроме того, мРНК альбумина была обнаружена в яичках и придатке яичка. Функциональные анализы, включающие оплодотворение в vitro , продемонстрировали, что этот высокомолекулярный комплекс играет роль в оплодотворении. Поскольку бесплодие у мышей и людей сильно связано с недостатком эпидидимальных молекул [46] — [48], и поскольку описанный здесь высокомолекулярный комплекс, содержащий альбумин, также экспрессируется придатком яичка человека (неопубликованные наблюдения), идентификация других молекул присутствие в эпидидимальном комплексе, распознаваемое mAb TRA 54, может быть полезным для понимания мужского бесплодия.

Благодарности

Мы благодарим доктора Йошитаке Нисимуне за его ценные комментарии, Марилию Лопес Хустино за ее отличную работу по редактированию и формированию окончательных изображений для этой статьи и Рикардо Геррейро Яноусека за помощь с выравниванием аминокислотной последовательности.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KFA MFB GHMFS HT MNE SH LEA LAVDP. Проведены эксперименты: KFA MFB GHMFS HT LEA. Проанализированы данные: КФА МФБ GHMFS HT MNE SH LEA LAVDP.Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HT MNE SH LEA LAVDP. Написал статью: KFA MFB HT SH LEA LAVDP.

Ссылки

1. 1.
   Корнуолл Г.А. (2009) Новое понимание биологии и функции придатка яичка. Обновление Hum Reprod 15: 213–227.
2. 2.
   Кастелла С., Фушекур С., Тейшейра-Гомеш А.П., Винь Дж., Бельгази М. и др. (2004) Идентификация члена новой РНКазы, семейства, специфически секретируемого эпидидимальным эпителием головы. Biol Reprod 70: 319–328.
3. 3.
   Хамил К.Г., Сивашанмугам П., Ричардсон Р.Т., Гроссман Г., Рубенс С.М. и др. (2000) HE2beta и HE2gamma, новые члены семейства андроген-регулируемых белков человека, специфичного для придатка яичка. Биол Репрод 141: 1245–1253.
4. 4.
   Dacheux JL, Castella S, Gatti LJ, Dacheux F (2005) Секреторная активность эпидидимальных клеток и роль белков в придатке сперматозоидов кабана. Териогенология 63: 319–341.
5. 5.
   Легаре C, Gaudreault C, St-Jacques S, Sullivan R (1999) Белок спермы P34H предпочтительно экспрессируется придатком яичка человека.Эндокринология 140: 3318–3327.
6. 6.
   Dacheux JL, Chavrier C, Lanson Y (1987) Подвижность и поверхностные трансформации сперматозоидов человека во время эпидидимального транзита. Ann New York Acad Sci 513: 560–563.
7. 7.
   Kaunisto K, Fleming RE, Kneer J, Sly WS, Rajaniemi H (1999) Региональная экспрессия и андрогенная регуляция карбоангидразы IV и II в придатке яичка взрослых крыс. Biol Reprod 61: 1521–1526.
8. 8.
   Mathur PP, Marshall A, Cheng CY (2000) Профили белков в различных эпидидимальных сегментах нормальных и кастрированных крыс.Азиатский Дж. Андрол 2: 57–64.
9. 9.
   Kirchhoff C, Osterhoff C, Pera I, Schröter S (1998) Функция эпидидимальных белков человека в созревании сперматозоидов. Андрология 30: 225–232.
10. 10.
    Watanabe D, Sawada K, Koshimizu U, Kagawa T., Nishimune Y (1992) Характеристика антигена, специфичного для мужских мейотических зародышевых клеток (meg-1), с помощью моноклонального антитела TRA 369 у мышей. Мол Репрод Дев 33: 307–312.
11. 11.
    Tulsiani DRP, Skudlarek MD, Holland MK, Orgebin-Crist MC (1993) Гликозилирование плазматической мембраны сперматозоидов крысы во время созревания придатка яичка.Biol Reprod 48: 417–428.
12. 12.
    Kirchhoff C, Hale G (1996) Перенос от клетки к клетке гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных мембранных белков во время созревания сперматозоидов. Мол Хум Репрод 2: 177–184.
13. 13.
    Перейра ЛАВД, Танака Х., Нагата Й., Савада К., Мори Х. и др. (1998) Характеристика и экспрессия специфического для стадии антигена моноклональным антителом TRA 54 в половых клетках семенников. Инт. Дж. Андрол 21: 34–40.
14. 14.
    Арротейа К.Ф., Жоазейро П.П., Ямада А.Т., Танака Х., Нишимуне И. и др.(2004) Идентификация и характеристика антигена, распознаваемого моноклональным антителом TRA54 в эпителиальных клетках придатка яичка и семявыносящего протока мыши. Дж. Андрол 25: 914–921.
15. 15.
    Ventelä S, Toppari J, Parvinen M (2003) Межклеточный трафик органелл через цитоплазматические мостики в ранних сперматидах крысы: механизмы совместного использования гаплоидных генных продуктов. Mol Biol Cell 14: 2768–2780.
16. 16.
    Laemmli UK (1970) Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага Т4.Природа 227: 680–685.
17. 17.
    Heisig M, Frentzen A, Bergmann B, Galmbacher K, Gentschev I, et al. (2011) Специфические взаимодействия антитело-рецептор запускают InlAB-независимое поглощение listeria monocytogenes линиями опухолевых клеток. BMC Microbiol 11: 163.
18. 18.
    Шевченко А., Вильм М., Ворм О., Манн М. (1996) Масс-спектрометрическое секвенирование белков из окрашенных серебром полиакриламидных гелей. Anal Chem 68: 850–858.
19. 19.
    Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS (1999) Идентификация белка на основе вероятности путем поиска в базах данных последовательностей с использованием данных масс-спектрометрии.Электрофорез 20: 3551–3567.
20. 20.
    Лохов П.Г., Тихонова О.В., Мошковский С.А., Гуфман Е.И., Серебрякова М.В. и др. (2004) Постобработка поиска в базе данных с помощью нейронной сети: расширенные возможности для идентификации компонентов в белковых смесях с использованием масс-спектрометрического картирования пептидов. Протеомика 4: 633–642.
21. 21.
    Larson JL, Miller DJ (1999) Простое гистохимическое окрашивание акросом на сперматозоидах нескольких видов. Мол Репрод Дев 52: 445–449.
22. 22.Ли С.Х., Ахуджа К.К. (1987) Исследование с использованием лектинов гликокомпонентов сперматозоидов мышей во время капситации и связывания сперматозоидов. J Reprod Fert 80: 65–74.
23. 23.
    Tao J, Crister ES, Crister JK (1993) Оценка акросомного статуса и жизнеспособности сперматозоидов мыши с помощью проточной цитометрии. Мол Репрод Дев 36: 183–194.
24. 24.
    Saxena DK, Tanii I, Yoshinaga K, Toshimori K (1999) Роль внутриакросомных антигенных молекул акрина 1 (MN7) и акрина 2 (MC41) в проникновении в блестящую оболочку при оплодотворении у мышей.J Reprod Fertil 117: 17–25.
25. 25.
    Махадеван М.М., Траунсон А.О. (1985) Удаление кумулюсного ооцита из человеческого ооцита для экстракорпорального оплодотворения. Fertil Steril 43 (2): 263–267.
26. 26.
    Манандхар Г., Тошимори К. (2001) Воздействие экваторина головки сперматозоида после акросомной реакции и его судьба после оплодотворения у мышей. Биол Репрод 65: 1425–1436.
27. 27.
    Tanpaichitr N, Hansen C (1994) Производство подвижных сперматозоидов мышей, прореагировавших на акросомы, с наномолярной концентрацией ионофора кальция A23187.Мол Репрод Дев 3: 326–334.
28. 28.
    Carles S, Fournier-Delpech S, Ribadeau-Dumas B (1992) Очистка овечьего андроген-зависимого эпидидимального белка: доказательства сильной гомологии аминокислотной последовательности с сывороточным альбумином. Reprod Nutr Dev 32: 277–284.
29. 29.
    Холл CJ, Perez FM, Kochins JG, Pettersen CA, Li Y, et al. (1996) Количественная оценка и локализация N-ацетил-бета-D-гексозаминидазы в семенниках и придатках яичка взрослых крыс. Biol Reprod 54: 914–929.
30. 30.
    Wassler M, Syntin P, Sutton-Walsh HG, Hsia N, Hardy DM, et al. (2002) Идентификация и характеристика связанного с цистатином эпидидимального сперматогенного белка в сперматозоидах человека: локализация в экваториальном сегменте. Биол Репрод 67: 795–803.
31. 31.
    Фон Хорстен Х. Х., Джонсон С. С., Сан-Франциско СК, Хастерт М.С., Велли С.М. и др. (2007) Олигомеризация и сшивание трансглутаминазой цистатина CRES в просвете придатка яичка мыши: потенциальный механизм внеклеточного контроля качества.J Biol Chem 282: 32912–32923.
32. 32.
    Chau KM, Cornwall GA (2011) Снижение фертильности in vitro у мышей, лишенных цистатина CRES (связанного с цистатином эпидидимального сперматогена): спасение путем воздействия на сперматозоиды дибутирил-цАМФ и изобутилметилксантина. Биол Репрод 84: 140–152.
33. 33.
    Fournier-Delpech S, Lewin LM, Oschry Y, Combarnous Y (1997) Связывание предальбуминов придатка яичка (PES) крысы и овцы со сперматозоидами крысы без влияния гетерологичной иммунизации на фертильность крыс.Мол Репрод Дев 47: 483–489.
34. 34.
    Fournier-Delpech S, Venien AM, Pisselet C, Courot M (1988) Локализация на голове сперматозоидов барана сайтов сродства к андроген-зависимому преальбумину придатка яичка. C R Acad Sci III 306: 333–338.
35. 35.
    Fournier-Delpech S, Holland MK, Skudlarek MD, Rankin TL, Orgebin-Crist MC и др. (1988) Секреторный белок придатка яичка барана имеет общие антигенные детерминанты с белками придатка яичка крысы и белками семенной плазмы человека.Reprod Nutr Dev 28: 1283–1299.
36. 36.
    Fournier-Delpech S, Courot M, Dubois MP (1985) Снижение фертильности и подвижности сперматозоидов у крыс, иммунизированных преальбуминовым эпидидимальным гликопротеином. Дж. Андрол 6: 246–250.
37. 37.
    Брукс Д.Е., Хиггинс Дж. (1980) Характеристика и андрогенная зависимость белков, связанных с люминальной жидкостью и сперматозоидами в придатке яичка крысы. J Reprod Fert 59: 363–375.
38. 38.
    Dacheux JL, Belleannée C, Jones R, Labas V, Belghazi M и др.(2009) Протеом придатка яичка млекопитающих. Рассмотрение. Эндокринол клеток Mol 306 (1-2): 45-50.
39. 39.
    Shamay A, Homans R, Fuerman Y, Levin I., Barash H, et al. (2005) Экспрессия альбумина в непеченочных тканях и его синтез молочной железой крупного рогатого скота. J Dairy Sci 88: 569–576.
40. 40.
    Nishio H, Dugaiczyc A (1996) Полная структура гена альфа-альбумина человека, нового члена мультигенного семейства сывороточного альбумина. Proc Natl Acad Sci USA 15: 7557–7561.
41. 41.Nishio H, Dugaiczyk A (1999) Полная структура гена альбумина человека, нового члена мультигенного семейства сывороточного альбумина. Proc Natl Acad Sci USA 93: 7557–7561.
42. 42.
    Нахон Дж. Л., Тратнер И., Полиард А., Пресс Ф, Пуаре М. и др. (1988) Экспрессия гена альбумина и альфа-фетопротеина в различных непеченочных тканях крыс. J Biol Chem 263: 11436–11442.
43. 43.
    Ан С.М., Бьюн К., Чо К, Ким Дж.Й., Ю Дж.С. и др. (2008) Клетки микроглии человека синтезируют альбумин в головном мозге.PLoS One 30: e2829.
44. 44.
    Brooks DE (1998) Андрогены регулируют секреторные белки придатка яичка, связанные с посттестикулярным развитием сперматозоидов. Ann NY Acad Sci 513: 179–194.
45. 45.
    Primakoff P (1994) Белки спермы изучаются для использования в противозачаточной вакцине. Рассмотрение. Am J Reprod Immunol 31: 208–210.
46. 46.
    Спила П., Купер Т.Г., Йунг Ч.Х., Мустонен М., Пенттинен Дж. И др. (2002) Дисфункция придатка яичка, инициированная экспрессией Т-антигена 40 обезьяньего вируса, приводит к искривленным жгутикам сперматозоидов и бесплодию у трансгенных мышей.Мол эндокринол 16: 2603–2617.
47. 47.
    Boué F, Sullivan R (1996) Случаи бесплодия человека связаны с отсутствием P34H, эпидидимального антигена сперматозоидов. Биол Репрод 54: 1018–1024.
48. 48.
    Сипила П., Купер Т.Г., Йунг Ч.Х., Мустонен М., Пенттинен Дж. И др. (2002) Дисфункция придатка яичка, инициированная экспрессией Т-антигена 40 обезьяньего вируса, приводит к искривленным жгутикам сперматозоидов и бесплодию у трансгенных мышей. Мол эндокринол 16: 2603–2617.

Экстраваскулярная масса альбумина и обмен в тканях крыс | Клиническая наука

1.Экстраваскулярный альбумин из туши, кожи и кишечника крыс экстрагировали и оценивали содержание альбумина несколькими методами. Анализ с помощью электрофореза на акриламидном геле, иммунодиффузии и радиоиммуноанализа полностью совпал. Используемый ранее метод, осаждение антителом с последующей экстракцией спиртом-TCA, занижает количество альбумина в экстрактах тканей, поскольку экстракция из осадка антител не завершена. Однако этот метод применим для определения удельной активности.

2. Нормальные крысы содержат от 500 до 650 мг альбумина на 100 г массы тела. Из них 20–25% находится в кровотоке, 35–40% — в туше (в основном, но не исключительно в мышцах), 20–25% — в коже и 10% — в кишечнике.

3. Внеклеточная вода в мышцах, туше, коже и кишечнике оценивалась по распределению маннита и сульфата. За исключением кишечника, оба метода полностью совпадали. Внеклеточная, внесосудистая вода составляет около 23% массы тела 150–200 г крыс.Внеклеточная вода в мышцах составляет около 20%, а в коже — 40%. В кишечнике внеклеточная вода не может быть надежно оценена этими соединениями.

4. В мышцах содержится около 3,5 мг / г внесосудистого альбумина; кожа и кишечник, 7–8 мг / г. Концентрация внесосудистого альбумина во внеклеточной воде мышц и кожи составляет 1620 мг / мл, или 50–60% от концентрации в плазме. В тонком кишечнике концентрация альбумина выше, возможно, такая же, как в плазме.

5. У крыс с тяжелым аминонуклеозидным нефрозом содержание альбумина в организме снижалось до 100–200 мг / 100 г.Из них 15–25% находились в плазме, 50% — в туше и около 15% — в коже. Асцитическая жидкость содержала всего несколько мг альбумина.

6. За удельной активностью внесосудистого альбумина тканей следили после внутрисосудистой инъекции ¹²⁵ I- или ¹³¹ I-меченного альбумина. Удельная активность альбумина туши быстро возрастает, становясь равной активности в плазме менее чем через 2 дня. Удельная активность альбумина в коже увеличивается намного медленнее и через 4 дня становится равной активности плазмы.Маркировка альбумина кишечника идет еще медленнее. Удельная активность в тканях никогда не превышает активности в плазме.

7. У крыс с тяжелым нефротическим заболеванием удельная активность в туше и коже становится равной активности в плазме в течение 2–3 дней и остается такой же после этого. Удельная активность альбумина в асцитической жидкости увеличивается и достигает значений в 16 раз больше, чем в плазме.